噪声诱导氧化应激中，ldha介导的血管纹内皮细胞糖酵解通过CX3CL1-CX3CR1通路调节巨噬细胞功能

　　

探寻噪声性听力损失新疗法：血管纹内皮细胞中 LDHA 介导的糖酵解作用研究解读

中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科医院的研究人员 Ying Yi、Min-Yu Wu、Kai-Tian Chen 等在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “LDHA-mediated glycolysis in stria vascularis endothelial cells regulates macrophages function through CX3CL1-CX3CR1 pathway in noise-induced oxidative stress” 的论文。该研究揭示了血管纹内皮细胞（SV-ECs）中与糖酵解相关的乳酸脱氢酶 A（LDHA）在噪声诱导的氧化应激中的关键作用，为噪声性听力损失（NIHL）的治疗提供了潜在的新靶点，对推动 NIHL 治疗领域的发展具有重要意义。

研究背景

噪声性听力损失（NIHL）严重影响着全球大量人群的生活质量，据世界卫生组织报告，超 12% 的世界人口受其困扰，约 11 亿年轻人因长期暴露于高分贝音乐面临永久性听力损失风险 。目前，NIHL 的发病机制尚未完全明晰，且缺乏 FDA 批准的有效治疗药物。

氧化应激对耳蜗的损伤被认为是 NIHL 的关键发病机制之一，其中血管纹（SV）受损备受关注。SV 位于耳蜗外侧壁，在维持耳蜗内电位和离子平衡方面发挥着重要作用。SV 中的内皮细胞（SV-ECs）是血迷路屏障（BBB）的重要组成部分，极易受到噪声诱导的氧化应激影响，进而破坏细胞间连接，打破内耳内环境稳态。然而，SV-ECs 氧化损伤的具体机制以及其与其他内耳细胞的相互作用仍有待深入探究。

细胞对氧化应激的反应是一个耗能过程，SV-ECs 生理状态下 85% 的能量来源于糖酵解，糖酵解通过乳酸脱氢酶 A（LDHA）将葡萄糖代谢为乳酸，为细胞的正常功能提供支持。已有研究表明，噪声暴露后耳蜗组织中的 ATP 水平下降，且与耳蜗毛细胞的永久性损失相关 。此外，糖酵解途径在听觉系统的发育和疾病过程中也扮演着重要角色，但 SV-ECs 是否利用糖酵解途径与内耳微环境中的其他细胞进行细胞间通讯尚不清楚。

巨噬细胞（Mφ）作为免疫系统的重要成员，广泛分布于人体各个器官和组织。在正常情况下，内耳中的驻留 Mφ 对维持内耳环境的稳态至关重要。但在 NIHL 发生时，耳蜗内 Mφ 的数量会在噪声损伤后显著增加，且形态和功能发生改变，引发持续性炎症反应，进一步损害内耳毛细胞和神经元，加重听力损失。不过，NIHL 过程中内耳 Mφ 功能障碍的免疫调节机制仍不明确。鉴于血管内皮细胞与 Mφ 之间存在相互作用的报道，研究人员推测氧化应激介导的 EC 损伤可能与内耳 Mφ 存在细胞间通讯。

研究材料方法和关键技术路线

研究材料

实验选用 C57BL/6 雄性小鼠，购自中山大学实验动物中心。实验中用到的 SV-ECs 细胞系，其培养方法参考先前研究并加以改良。实验所需的各种抗体、试剂、试剂盒等均有明确的来源，如 RNA 干扰所用的 siRNA 购自 RiboBio 公司，LDHA 过表达慢病毒由 Genechem 公司构建等。

研究方法

1. NIHL 小鼠模型构建：将小鼠随机分为噪声暴露组和对照组。噪声暴露组小鼠在通风隔音柜中暴露于 120 dB、2 - 20 kHz 的宽带噪声 2 小时；对照组小鼠置于相同环境但不接受噪声暴露。
2. 细胞实验：包括 SV-ECs 的培养、RNA 干扰、慢病毒转染、细胞活力检测、细胞内活性氧（ROS）检测、细胞迁移和管形成实验、乳酸释放检测等。通过这些实验，研究人员探究了氧化应激对 SV-ECs 功能的影响以及 LDHA 在其中的作用。
3. 动物实验：涵盖听觉脑干反应（ABR）测量、鼓膜内注射、组织制备、免疫荧光、Western blot、定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、单细胞分离及流式细胞术分析等。这些实验用于评估小鼠听力变化、检测相关蛋白和基因表达水平、分析细胞表型等。

关键技术路线

首先构建 NIHL 小鼠模型和体外 SV-ECs 氧化应激模型，分别从体内和体外研究噪声诱导的氧化应激对 SV-ECs 的影响。通过 RNA 干扰和慢病毒转染技术调控 SV-ECs 中 LDHA 的表达，观察其对细胞功能和相关信号通路的影响。利用蛋白质组学技术分析 SV-ECs 分泌蛋白的差异，筛选出潜在的细胞间通讯介质。最后，通过体内外实验验证 LDHA 通过 CX3CL1-CX3CR1 途径调节 Mφ 功能的机制。

研究结果

SV-ECs 功能受噪声诱导的氧化应激破坏

通过建立 NIHL 小鼠模型，研究人员发现噪声暴露后，小鼠听力功能在 1 天、3 天和 14 天显著下降，同时外毛细胞凋亡在 14 天明显减少，耳蜗中氧化应激指标 3NT 蛋白表达在噪声暴露 1 天后显著升高，表明内耳在 NIHL 后发生了氧化应激。

对耳蜗进行冷冻切片 HE 染色，发现噪声暴露 1 天和 3 天后，SV 结构受损、肿胀，血管横截面积显著增加，尤其是在耳蜗的中部和底部转。同时，SV-ECs 遭到破坏，3NT 表达增加，抗氧化基因 SOD1、SOD2 和 GSR 的 mRNA 表达水平下降。

在体外，利用 H?O?建立 SV-ECs 氧化应激损伤模型，结果显示氧化应激抑制了 SV-ECs 的管形成、迁移能力，破坏了屏障完整性，增加了 ROS 水平，降低了抗氧化基因的表达。这些结果表明，噪声诱导的氧化应激会损害 SV-ECs 的功能。

氧化应激改变体内外 SV-ECs 的糖酵解

研究人员先前利用 LC-MS/MS 技术分析了 H?O?处理的 SV-ECs 中差异表达的蛋白质，发现差异蛋白富集的途径主要与糖酵解相关，包括 LDHA、ALDOA、PGK1 等。

进一步对暴露于 500 μM H?O?的 SV-ECs 进行 qRT-PCR 和 Western blot 分析，结果显示 H?O?处理 2 小时后，大多数糖酵解相关基因的表达显著下降，去除刺激后 2 小时、6 小时和 24 小时逐渐增加，但 Western blot 分析显示所有糖酵解相关蛋白水平无显著变化。持续用 H?O?处理 48 小时后，发现只有糖酵解相关的 LDHA 的 mRNA 和蛋白表达显著降低。

在体内实验中，对 NIHL 小鼠模型的 SV 组织进行分析，发现噪声暴露 2 小时后，大多数糖酵解相关基因水平显著下降，1 天后有所恢复；LDHA、PKM 和 G3P 等糖酵解相关蛋白的表达在噪声暴露 2 小时后也显著下降，随后逐渐增加。这表明噪声诱导的氧化应激会迅速抑制 SV-ECs 中糖酵解相关 LDHA 的表达。

LDHA 抑制降低 SV-ECs 活力并促进其抗氧化反应

通过 siRNA 降低 SV-ECs 中 LDHA 的表达，并用 qRT-PCR 和 Western blot 进行验证。结果显示，LDHA 抑制后，SV-ECs 释放的乳酸显著减少，使用 LDHA 小分子抑制剂 az-33 也得到了类似的结果。

细胞活力检测（CCK8）表明，用 siLDHA 和 az-33 处理后，SV-ECs 的活力显著降低。此外，LDHA 抑制还显著损害了 SV-ECs 的屏障完整性和迁移能力，同时增加了抗氧化基因 SOD1、SOD2 和 CAT 的 mRNA 表达。这说明抑制 LDHA 会降低 SV-ECs 的活力，同时增强其抗氧化功能。

SV-ECs 中 LDHA 的抑制对 Mφ 具有抗炎作用

免疫荧光分析显示，噪声暴露 7 天后，耳蜗的 SV、螺旋神经节神经元（SGNs）、蜗轴和螺旋韧带内的 Mφ（Iba1?）显著增加。流式细胞术分析发现，耳蜗 Mφ 中 CD86/CD206 的比例增加，但促炎 CD86 Mφ 的百分比仅接近显著趋势，抗炎 CD206 Mφ 的百分比无显著差异。

在体外，用 siLDHA 处理的 SV-ECs 的分泌组刺激 Mφ，qRT-PCR 结果显示，6 小时时抗炎因子 Fizz1 的水平显著增加，ELISA 检测发现促炎因子 IL-6 和 TNF-α 的水平显著降低。在体内，鼓膜内注射 siLDHA 显著抑制了 LDHA 的表达，qRT-PCR 分析表明，抗炎因子 Fizz1 和 Arg1 的水平显著增加，而促炎细胞因子 IL-6、TNF-α 和 IL-1β 的水平不受影响，同时蜗轴中促炎 CD86 Mφ 的水平显著降低。这些数据表明，LDHA 对 Mφ 具有促炎作用，抑制 LDHA 则具有抗炎作用。

LDHA 通过 CX3CL1-CX3CR1 途径调节 SV-ECs 介导的 Mφ 功能障碍

对 siNC 和 siLDHA 处理的 SV-ECs 分泌组进行蛋白质组学分析，共鉴定出 16 种差异蛋白，KEGG 分析表明这些蛋白主要参与病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、细胞因子 - 细胞因子受体相互作用等途径。

研究发现，CX3CL1 在 H?O?处理的 SV-ECs 中表达升高，抑制 LDHA 后表达降低。中和 CX3CL1 后，H?O?处理的 SV-ECs 分泌组刺激的 Mφ 中炎症因子 TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表达显著降低，ELISA 检测显示 TNF-α 和 IL-6 的水平也显著降低。免疫荧光分析表明，NIHL 小鼠的 SV-ECs 中存在 CX3CL1。此外，噪声暴露后耳蜗中 CX3CL1 的表达增加，鼓膜内注射 siLDHA 后表达降低。

通过慢病毒转染建立 LDHA 过表达的 SV-ECs，并用 siRNA 沉默 CX3CL1 的表达。结果显示，用 LDHA 过表达且 CX3CL1 沉默的 SV-ECs 分泌组处理 Mφ 24 小时后，Mφ 中炎症因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的 mRNA 水平和分泌水平均显著降低。这表明 CX3CL1-CX3CR1 途径参与了 LDHA 介导的 SV-ECs 对 Mφ 的促炎作用。

研究结论和讨论

研究发现，H?O?和噪声诱导的氧化应激在急性期会导致 SV-ECs 功能损伤，且首次揭示了氧化应激损伤后，H?O?刺激的 SV-ECs 和噪声诱导的小鼠 SV 中糖酵解相关蛋白的表达发生显著改变，早期 LDHA 的降低最为明显。抑制 LDHA 在氧化应激诱导的 SV-ECs 损伤中起重要作用，同时介导了对 Mφ 的抗炎作用。此外，研究还发现糖酵解相关的 LDHA 通过 CX3CL1-CX3CR1 信号通路调节 SV-ECs 与 Mφ 之间的相互作用。

SV-ECs 在维持血迷路屏障完整性方面至关重要，本研究表明氧化应激会损害 SV-ECs 的迁移和血管生成能力，导致其产生过量 ROS，降低抗氧化基因表达。这可能是一种负反馈机制，旨在维持耳蜗的氧化平衡。同时，研究发现糖酵解途径在 SV-ECs 应对氧化应激中起重要作用，LDHA 是关键调节因子。

LDHA 对 Mφ 的调节作用为 NIHL 的研究提供了新视角。以往研究主要关注 CX3CL1-CX3CR1 信号通路在耳蜗螺旋神经节神经元与 Mφ 之间的相互作用，本研究首次揭示了 SV-ECs 中 LDHA 通过该信号通路对 Mφ 发挥抗炎作用。不过，该研究也存在一定局限性，如需要通过在 SV-ECs 中特异性敲低 LDHA 的小鼠模型进行体内实验，进一步验证研究结果；同时，研究主要关注了分泌组对 Mφ 功能的直接影响，其对其他细胞如 SGNs 和毛细胞的间接影响有待进一步研究；此外，采用更先进的技术如流式细胞术和多重免疫组化，将更全面地了解内耳 Mφ。

尽管如此，该研究为 NIHL 的治疗提供了新的潜在靶点 ——SV-ECs 中的 LDHA，有望推动 NIHL 治疗领域的进一步发展，为开发新的治疗方法奠定理论基础。