血清素对肠道炎症的调节作用研究解读
来自捷克共和国布尔诺圣安妮大学医院国际临床研究中心等多个单位的研究人员,在《Experimental & Molecular Medicine》期刊上发表了题为 “Serotonin attenuates tumor necrosis factor-induced intestinal inflammation by interacting with human mucosal tissue” 的论文。该研究通过构建人体三维体外培养模型,深入探究了血清素对免疫细胞与肠道组织相互作用的影响,为揭示肠道 - 脑轴的调控机制以及炎症性肠病(IBD)的治疗提供了关键线索,在肠道生理病理研究领域具有重要意义。
一、研究背景
肠道 - 脑轴包含中枢神经系统与肠神经系统(ENS)间的双向互动,对维持肠道内稳态至关重要。肠道黏膜能响应神经信号,肠内分泌细胞(EECs)是神经调节剂的主要来源,然而 ENS 在肠道组织与微生物群相互作用及黏膜免疫系统失调引发炎症过程中的作用尚未明确。
肠道组织是人体最大的免疫细胞储存库,巨噬细胞(Mφs)在其中数量丰富且功能多样。在病理状态下,如 IBD,单核细胞 - Mφ 分化异常,会导致细菌清除能力受损、细胞因子产生失调,进而加重组织损伤。肿瘤坏死因子(TNF)在肠道炎症发病机制中作用关键,虽对其在炎症中的促细胞死亡作用研究较多,但 TNF 刺激对黏膜组织的影响及与肠道 - 脑轴的联系仍不清晰。
神经调节剂在人体生理功能调节和内稳态维持中发挥重要作用,多巴胺和血清素大多在肠道产生,且均参与 IBD 的炎症和发病过程。血清素对单核细胞趋化性有影响,但其具体机制尚不明确。
动物模型在研究人类炎症性疾病机制方面虽有重要发现,但啮齿动物和人类在病原体易感性、微生物群组成以及 Toll 样受体(TLR)表达等方面存在差异,导致体内实验结果难以直接应用于人类。因此,构建基于人类细胞的肠道类器官(IO)模型对研究神经调节剂在肠道黏膜组织中的作用至关重要。
二、研究材料与方法
(一)细胞培养与类器官分化
人类诱导多能干细胞(hiPS)在 Matrigel 包被的培养皿中,用 mTeSR Plus 培养基培养,当细胞达到约 80% 汇合度时进行传代。hiPS 细胞经三步法诱导分化为肠道类器官(IOs),分化完成后用于后续实验。
(二)检测方法
- 免疫荧光(IF)染色与免疫组化:IOs 经固定、透化、封闭等处理后,分别用相应的一抗、二抗及染色剂处理,用于观察组织的结构和细胞标记物表达。
- IO 解离与流式细胞术分析:IOs 解离后,用荧光素偶联抗体标记细胞,通过流式细胞仪检测细胞亚群的表达情况。
- RNA 提取与基因表达分析:采用 TRI Reagent 裂解细胞,提取 RNA 后用于 RNA 测序(RNAseq)、RT2 Profiler PCR Array 或定量聚合酶链反应(qPCR),以研究基因表达变化。
(三)实验处理
用含化学触发剂但无生长因子的 IO 培养基刺激 50 天以上的 IOs,研究神经调节剂(血清素、多巴胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱)和 TNF 对肠道组织的影响。设置未处理对照组,不同处理组用于不同检测分析。
(四)细胞分离与相关实验
- PBM 细胞与单核细胞分离:从人血样本中分离外周血单个核(PBM)细胞和单核细胞,并对部分细胞进行标记。
- 趋化 / 迁移实验与共培养实验:将 PBM 细胞用于趋化 / 迁移实验,研究 IOs 释放的趋化因子对免疫细胞迁移的影响;将单核细胞与经不同处理的 IOs 共培养,分析单核细胞的迁移和表型变化。
(五)统计分析
使用 GraphPad Prism 9 进行统计分析,数据以均值和标准误表示,在进行参数或非参数统计检验前先进行正态性检验。
三、研究结果
(一)类器官为研究黏膜内稳态提供复杂环境
通过 IF 标记和多种染色方法对 hiPS 细胞来源的 IOs 进行研究,发现 IOs 具有与体内人类肠道组织相似的结构和功能,包含上皮细胞、间充质细胞、肠内分泌细胞和潘氏细胞等,且免疫细胞 CD45 阴性,这为研究肠道 - 脑轴内稳态维持机制提供了良好模型。
(二)TNF 刺激 IOs 引发肠道组织趋化和促炎细胞因子反应
用 TNF 刺激 IOs 4 小时后进行 RNAseq 分析,发现 1415 个差异表达基因(DEGs),其中 919 个上调,496 个下调。GO 分析显示,TNF 刺激使 IOs 中与免疫细胞趋化和促炎相关的信号通路富集,同时 IOs 中 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5 和 TLR6 表达较高,表明 IOs 可用于研究肠道炎症以及 TLR 信号在黏膜细胞炎症反应中的作用。
(三)神经调节剂调节 IOs 中 TLR 表达
研究发现 IOs 表达多种神经调节剂受体,用神经调节剂刺激 IOs 后,通过 RT2 Profiler PCR array 和 qPCR 检测发现,多种 TLR 表达下降,IF 染色在蛋白水平也证实了这一结果,说明神经调节剂可通过调节 TLR 表达调控体内黏膜组织的免疫反应。
(四)血清素对健康黏膜组织具有适度的非炎症作用
用血清素刺激 IOs 后进行 RNAseq 分析,发现 249 个 DEGs,其中 211 个上调,38 个下调。GO 分析表明,血清素处理的样本中富集的通路与组织重塑相关,说明血清素在健康肠道组织中通过紧密连接组装影响上皮屏障完整性。
(五)血清素降低 TNF 诱导的肠道炎症中趋化因子表达
在 TNF 诱导的炎症模型中,血清素存在时的 DEGs 数量(695 个)少于 TNF 单独处理时(1415 个),且多数基因在血清素存在时下调。GO 分析显示,差异表达基因主要参与白细胞趋化和迁移途径,且血清素显著降低了 CCL2、CXCL1 等多种趋化因子的表达,表明血清素可减轻 TNF 诱导的炎症。
(六)血清素改变 TNF 诱导炎症时肠道组织吸引单核细胞的能力
趋化和迁移实验表明,血清素对健康组织中免疫细胞的趋化性无影响,但在 TNF 诱导的炎症中,血清素可改变不同单核细胞亚群的趋化性,增加经典单核细胞的趋化性,降低非经典单核细胞的趋化性。
(七)血清素重塑黏膜组织影响组织迁移单核细胞的表型和命运
单核细胞与经不同处理的 IOs 共培养实验发现,血清素可改变单核细胞向 IOs 的迁移,影响单核细胞的迁移标记物和激活标记物表达,表明血清素通过重塑 IO 组织影响单核细胞的迁移和表型。
四、研究结论与讨论
该研究利用三维人体体外模型,揭示了血清素在调节肠道炎症中的重要作用。血清素可调节黏膜组织中 TLR 表达,影响肠道组织对 TNF 的反应,减轻 TNF 诱导的炎症,改变单核细胞的迁移和表型,在肠道 - 脑轴、肠道组织与免疫系统的相互作用中发挥关键作用。
研究还发现,IOs 中 TLR 的表达模式和定位与小鼠不同,神经调节剂对 TLR 表达的影响存在差异,这为深入理解肠道免疫反应的调控机制提供了新视角。
以往基于小鼠模型的研究对血清素在肠道炎症中的作用存在争议,本研究基于人体模型的结果表明,血清素在人类黏膜组织中不诱导促炎反应,提示在将小鼠模型结果转化为人类健康研究时需谨慎。
此外,血清素对单核细胞迁移和表型的影响表明其在调节肠道免疫反应中具有独特作用,可能成为 IBD 治疗的新靶点。未来研究可进一步探究血清素信号通路的分子机制,以及血清素在其他慢性炎症性疾病中的作用,为相关疾病的治疗提供更多理论依据和潜在治疗策略。
综上所述,该研究为肠道炎症的病理机制研究和治疗提供了重要的理论基础,对推动肠道生理病理领域的发展具有重要意义。