类风湿关节炎的严重程度是由滑膜细胞和成熟破骨细胞之间的串扰通过钙和细胞因子反馈回路介导的

【字体: 时间:2025年02月04日 来源:Experimental & Molecular Medicine 9.5

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类风湿关节炎研究新进展:滑膜细胞与成熟破骨细胞的交互作用及潜在治疗策略


韩国加图立大学(Gachon University)的 Eun Sun Lee 等研究人员在《Experimental & Molecular Medicine》期刊上发表了题为 “Rheumatoid arthritis severity is mediated by crosstalk between synoviocytes and mature osteoclasts through a calcium and cytokine feedback loop” 的论文。该研究揭示了类风湿关节炎(RA)进展中滑膜细胞与破骨细胞的交互作用机制,为开发治疗 RA 的新策略提供了重要依据,有助于改善 RA 患者的治疗效果,对攻克这一复杂疾病具有重要意义。

一、研究背景


类风湿关节炎(RA)是一种慢性侵袭性的自身免疫性疾病,可引发关节疼痛、肿胀、畸形,严重影响患者的生活质量 。其主要病理特征包括滑膜炎症、关节肿胀、成纤维样滑膜细胞(FLSs)增生、血管翳形成和骨破坏。虽然目前对 RA 的发病机制有了一定了解,临床治疗也取得了一些进展,但由于 RA 的复杂性,其确切发病机制仍未完全阐明,部分患者对现有治疗方案反应不佳,因此亟需探索新的治疗靶点和策略。

钙离子()作为重要的信号信使,在骨重塑过程中发挥关键作用。成熟破骨细胞可从骨中释放,而 FLSs 会受到炎症细胞因子的影响。研究人员推测,骨释放的可能激活 FLSs,二者通过细胞因子和形成反馈环路,进而加剧 RA 患者的骨损伤 。此外,先前研究发现钠 - 碳酸氢盐协同转运蛋白 NBCn1 参与调节 FLSs 的侵袭性,因此,研究 NBCn1 在破骨细胞生成中的作用,以及抑制该蛋白是否能阻断滑膜细胞与破骨细胞之间的反馈环路,对治疗 RA 具有重要意义。

二、研究材料和方法


  1. 患者滑膜液收集:招募 16 名患者,包括 8 名 RA 患者和 8 名膝骨关节炎(OA)患者,收集其膝关节积液。RA 患者符合 2010 年美国风湿病学会 / 欧洲抗风湿病联盟分类标准,且未使用生物改善病情抗风湿药(DMARDs)。滑膜液经离心后储存于 - 20°C 备用。
  2. 细胞培养:从 Cell Applications 购买人源 RA - FLSs 和 OA - FLSs;从 C57BL/6N 小鼠膝关节分离小鼠 FLSs(Ms - FLS)。采用 α - MEM 培养基添加 1% 青霉素 - 链霉素和 10% 胎牛血清培养细胞,培养条件为 37°C、5%。同时,从 C57BL/6N 小鼠骨髓获取骨髓巨噬细胞(BMMs),经诱导分化为破骨细胞;RAW264.7 细胞在含 M - CSF 和 RANKL 的培养基中培养分化为破骨细胞。
  3. 实验检测方法:运用多种实验技术进行检测,如用比色测定试剂盒测量滑膜液中浓度;通过总 RNA 测序、KEGG 通路富集分析和 GO 富集分析评估基因表达模式;利用 RT - qPCR 检测基因 mRNA 表达水平;采用 Transwell 膜迁移实验检测 FLSs 迁移能力;借助免疫染色、MTT 法、测量 NBC 活性、免疫荧光染色和共聚焦成像等方法评估细胞相关指标;构建胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型,评估药物对疾病的治疗效果。

三、研究技术路线


研究人员首先测量患者滑膜液中浓度,对比 RA 与 OA 患者的差异。接着对 RA - FLSs 进行 RNA 测序和富集分析,探究细胞因子和对 FLSs 的影响。之后,用不同条件处理 FLSs 和破骨细胞,检测相关因子表达、细胞活性和功能变化。在细胞实验基础上,构建 CIA 小鼠模型,给予 NBC 抑制剂 S0859 处理,观察小鼠关节症状、骨吸收指标和组织学变化,以此全面深入地研究滑膜细胞与破骨细胞之间的交互作用机制及潜在治疗策略。

四、研究结果


(一)细胞因子和高介导的 FLSs 激活诱导骨破坏因子表达和 NBC 激活


与 OA 患者相比,RA 患者滑膜液中水平略有升高,但无统计学差异。经 TNF 处理的人 RA - FLSs 中,细胞因子信号、趋化因子信号、黏附、T 细胞分化和破骨细胞生成相关基因表达增加。高(3 mM)刺激下,TNF 和 3 mM 共同处理人 RA - FLSs,可增加 RANKL 和 M - CSF 的 mRNA 表达,促进 FLS 迁移,同时提高 CaSR、SLC4A7 的 mRNA 表达及 NBC 活性,且 TNF 和 3 mM 具有协同作用。该结果通过测量滑膜液浓度、RNA 测序、RT - qPCR、细胞迁移实验和 NBC 活性检测等实验得出。

(二)暴露于细胞因子和高水平的 FLSs 培养基诱导破骨细胞中 NFATc1 激活


用 3 mM 处理分离的小鼠原代 Ms - FLSs,可增加炎症细胞因子 Tnf、Il - 1、Il - 6 和 Il - 8 的 mRNA 表达。细胞因子处理的 FLSs 培养基能促进 Ms - FLSs 表达 M - CSF mRNA。将不同条件的 FLSs 培养基作用于 Raw264.7 细胞和原代 BMMs,发现经 TNF 处理的 FLSs 培养基(Fm - T)可显著增加 Raw264.7 细胞中 NFATc1 蛋白表达,促进 BMMs 中 NFATc1 核定位。此结论通过 RT - qPCR、蛋白免疫印迹和免疫荧光染色等实验证实。

(三)暴露于细胞因子的 FLS 培养基刺激破骨细胞成熟,表现为 TRAP 染色阳性和骨基质吸收增加


用 M - CSF、RANKL 和 FLS 培养基培养破骨细胞,进行 TRAP 染色和坑实验。结果显示,M - CSF + RANKL 处理组(+ M + R)和 Fm - T 处理组的 Raw264.7 细胞及 BMMs 的 TRAP 染色显著阳性,破骨细胞数量和可溶性 TRAP 水平增加,骨吸收坑面积增大。用 M - CSF 抗体处理 Fm - T 组后,破骨细胞形成受到抑制。这一系列结论由 TRAP 染色、坑实验、可溶性 TRAP 测量等实验支撑。

(四)成熟破骨细胞释放的成分增强 FLS 迁移


将 Raw264.7 细胞培养至成熟,其条件培养基可促进 FLS 迁移,且这种促进作用依赖于,去除或使培养基失活后,FLS 迁移能力下降。该结果通过 Transwell 迁移实验、添加螯合剂 BAPTA 和制备失活培养基等实验得出。

(五)破骨细胞激活揭示迁移模块 NBC 的表达增强


M - CSF 和 RANKL 处理可增加 Raw264.7 细胞中 Slc4a7 mRNA 和 NBCn1 蛋白表达,提高细胞膜上 NBCn1 表达和 NBC 活性。此结论通过 RT - qPCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光染色和 NBC 活性检测等实验验证。

(六)NBC 抑制减弱 Raw264.7 细胞的破骨细胞生成和骨吸收


用 NBC 抑制剂 S0859 处理 Raw264.7 细胞,可减弱 M - CSF + RANKL 介导的 NBC 活性,抑制多核细胞融合,减少成熟破骨细胞数量和骨吸收,降低 NFATc1 蛋白表达。该结论依据 NBC 活性检测、TRAP 染色、坑实验和蛋白免疫印迹等实验结果得出。

(七)NBC 抑制减弱 BMMs 的破骨细胞生成和骨吸收


在 BMMs 中,S0859 同样可降低 M - CSF + RANKL 介导的 NBC 活性,抑制多核细胞融合和骨吸收,减少 NFATc1 表达,但不影响 FLSs 活力。相关实验证据包括 NBC 活性检测、TRAP 染色、坑实验、免疫荧光染色和蛋白免疫印迹等。

(八)NBC 抑制剂 S0859 处理的破骨细胞培养基不诱导 FLS 迁移


经 S0859 处理的成熟 BMMs 条件培养基,可抑制由其释放的牙本质成分介导的 FLS 迁移,同时减弱细胞因子介导的 Ms - FLSs 中 M - CSF 的增加。该结果通过 Transwell 迁移实验和测量 M - CSF 分泌浓度等实验获得。

(九)S0859 对 CIA 小鼠模型骨吸收的抑制作用


在 CIA 小鼠模型中,S0859 注射组小鼠的爪肿胀、爪厚度和爪评分降低,血清中骨吸收标志物 CTX - 1 水平下降,骨切片 TRAP 染色显示破骨细胞生成区域减少,微 CT 检测表明骨密度恢复。这表明 S0859 可减轻 RA 相关病理变化和骨吸收功能。这些结论通过建立 CIA 小鼠模型,测量爪部指标、血清 CTX - 1 水平、骨切片 TRAP 染色和微 CT 检测等实验得出。

五、研究结论


本研究证实了在 RA 相关细胞和小鼠模型中,炎症细胞因子与骨释放的会提高 RA - FLSs 中骨吸收因子 M - CSF 水平,RA - FLSs 释放的因子可增强破骨细胞的骨吸收活性,破骨细胞骨吸收产物又通过调节 NBCn1 促进 FLS 迁移。同时,分泌的与 RA 相关的因子可介导破骨细胞生成,抑制 NBC 活性能够减弱这一过程。此外,S0859 对 CIA 小鼠模型的骨损伤和破骨细胞生成活性具有抑制作用。

六、讨论


研究首次揭示了 FLSs 与破骨细胞之间通过和细胞因子反馈环路的直接相互作用机制。炎症细胞因子和在该反馈环路中发挥关键作用,激活 FLSs,进而参与 RA 病理过程。抑制 NBCn1 不仅能减弱破骨细胞生成、减少骨吸收面积,还能抑制 FLSs 的侵袭表型,提示调节破骨细胞中的 NBCn1 可能是调节骨稳态的新策略。

目前 RA 治疗面临诸多挑战,现有治疗方案存在个体差异大、部分患者无响应、长期使用有安全隐患等问题。本研究为 RA 治疗提供了新的方向,即通过控制炎症细胞因子和释放,调节 FLSs 与破骨细胞之间的交互作用,有望开发出更有效的治疗药物。后续研究可进一步明确滑膜液中其他相关成分在和细胞因子反馈环路中的作用,推动 RA 治疗策略的创新发展。

综上所述,该研究成果为深入理解 RA 发病机制提供了重要理论依据,为开发更精准有效的治疗方案奠定了基础,对改善 RA 患者的预后具有重要意义,有望为 RA 治疗带来新的突破。

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