磷脂酶C β4通过与MKK3和p38 MAPK相互作用促进rankl依赖性破骨细胞的发生

【字体: 时间:2025年02月04日 来源:Experimental & Molecular Medicine 9.5

编辑推荐:

  

  

磷脂酶 Cβ4 调控破骨细胞生成机制的研究进展


韩国庆北国立大学医学院生物化学与细胞生物学系、细胞与基质研究所的 Dong-Kyo Lee、Xian Jin 等研究人员在《Experimental & Molecular Medicine》期刊上发表了题为 “Phospholipase C β4 promotes RANKL-dependent osteoclastogenesis by interacting with MKK3 and p38 MAPK” 的论文。该研究揭示了磷脂酶 Cβ4(PLCβ4)在破骨细胞生成中的关键调控作用,为骨质疏松等骨疾病的治疗提供了潜在的新靶点,在骨生物学研究领域具有重要意义。

一、研究背景


破骨细胞起源于单核细胞 / 巨噬细胞谱系细胞,是负责骨吸收的多核细胞。其分化过程依赖巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子 κB 受体激活剂配体(RANKL) 。RANKL 与受体 RANK 结合后,招募衔接分子肿瘤坏死因子受体相关因子 6(TRAF6),激活转化生长因子 -β 激活激酶 - 1(TAK1),进而激活 IκB 激酶(IKK)复合物和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs),最终诱导破骨细胞分化关键转录因子活化 T 细胞核因子细胞质 1(NFATc1)的表达,促进破骨细胞特异性基因的表达。

在 MAPKs 中,p38 MAPK 在破骨细胞分化和骨稳态中起重要作用。研究表明,敲除破骨细胞谱系中 p38α 的小鼠骨量增加,破骨细胞数量减少;使用 p38 抑制剂可预防动物模型中的炎症或卵巢切除诱导的骨丢失。

磷脂酶 C(PLC)家族通过水解磷脂酰肌醇 - 4,5 - 二磷酸参与磷酸肌醇代谢,其功能或表达失调与多种疾病相关。PLCβ4 是 PLCβ 亚家族成员,在神经和视网膜组织中高表达,已知其在神经系统功能、免疫反应等方面有重要作用,但在骨细胞,尤其是破骨细胞中的作用尚不清楚。

二、研究材料与方法


(一)实验动物


实验使用 C57BL/6 背景的 PLCβ4 全球敲除(KO)小鼠和通过 LysM - Cre 系统构建的破骨细胞谱系特异性 PLCβ4 条件性敲除(LysM - PLCβ4-/-)小鼠。所有小鼠饲养在特定病原体无污染的环境中,实验动物操作经庆北国立大学动物实验伦理委员会批准。

(二)试剂与抗体


研究使用重组人 RANKL、M - CSF,以及针对 PLCβ4、磷酸化 IκBα、磷酸化 JNK、磷酸化 ERK、磷酸化 p38 等多种蛋白的抗体。

(三)细胞培养与处理


从 8 - 9 周龄小鼠长骨中分离原代骨髓来源的巨噬细胞(BMMs),经培养获得破骨细胞前体,再用 M - CSF 和 RANKL 诱导其分化为破骨细胞。通过慢病毒介导的小发夹 RNA(shRNA)沉默 PLCβ4 表达,用嘌呤霉素筛选稳定转导的细胞。

(四)实验检测方法


  1. 基因表达分析:采用微阵列分析、定量实时聚合酶链反应(qRT - PCR)检测基因表达水平。
  2. 蛋白分析:运用免疫印迹和免疫沉淀技术检测蛋白表达、磷酸化水平及蛋白间相互作用。
  3. 细胞增殖检测:使用 3 - (4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基) - 5 - (3 - 羧甲氧基苯基) - 2 - (4 - 磺基苯基) - 2H - 四唑鎓(MTS)法检测细胞增殖。
  4. 骨组织分析:利用显微计算机断层扫描(μCT)、组织学和骨组织形态计量学分析评估骨结构和细胞参数;通过免疫荧光测定观察蛋白共定位。
  5. 统计分析:借助 Microsoft Excel 2016 或 GraphPad Prism 9 软件进行统计分析,采用 Student’s t 检验确定组间差异的显著性。

三、研究结果


(一)PLCβ4 在破骨细胞生成过程中表达上调


研究人员将 BMMs 与 M - CSF 和 RANKL 共培养诱导破骨细胞生成,通过微阵列分析发现 RANKL 强烈诱导 PLCβ4 表达,多种破骨细胞生成相关基因也上调。qRT - PCR 结果显示,破骨细胞生成过程中 PLCβ1 和 PLCβ3 的 mRNA 水平下降,而 PLCβ4 的 mRNA 表达显著上调,蛋白水平也随之升高。进一步研究发现,RANKL 介导的 PLCβ4 表达上调主要通过 NF - κB 和 p38 MAPK 途径,NF - κB 抑制剂 Bay11 - 7802 和 p38 抑制剂 SB203580 可显著抑制其上调。

(二)PLCβ4 敲低减少破骨细胞分化


慢病毒介导的 PLCβ4 - shRNA 有效降低了 BMMs 和前破骨细胞中 PLCβ4 的 mRNA 表达。敲低 PLCβ4 显著抑制了不同浓度 RANKL 诱导的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性多核细胞形成,降低了培养上清液中的 TRAP 活性,但不影响破骨细胞前体的增殖。此外,PLCβ4 敲低显著减弱了 NFATc1、TRAP、组织蛋白酶 K(CTSK)等多种破骨细胞特异性基因的诱导表达。

(三)PLCβ4 的全球缺失减少破骨细胞生成


PLCβ4 全球敲除小鼠体型小于野生型小鼠,但胚胎期 17.5 天除下颌骨发育外,骨骼发育无明显差异。对敲除小鼠 BMMs 进行免疫印迹分析,证实 PLCβ4 缺失且不影响 PLCβ2 蛋白水平。培养敲除小鼠和野生型小鼠的 BMMs,结果显示敲除小鼠的破骨细胞数量显著减少,破骨细胞标记基因表达下调,而破骨细胞前体的增殖不受影响。

(四)破骨细胞谱系特异性缺失 PLCβ4 减少破骨细胞生成


构建破骨细胞谱系特异性 PLCβ4 条件性敲除小鼠(LysM - PLCβ4-/-),免疫印迹确认 BMMs 和破骨细胞中 PLCβ4 缺失且 PLCβ2 蛋白水平不变。培养敲除小鼠和对照小鼠的 BMMs,发现敲除小鼠的破骨细胞数量显著降低,破骨细胞前体增殖、迁移和凋亡不受影响,破骨细胞特异性基因的 mRNA 和蛋白表达均显著下降。

(五)LysM - PLCβ4-/- 雄性小鼠骨量增加且破骨细胞数量减少


对 8 周龄的对照小鼠和 LysM - PLCβ4-/- 小鼠进行 μCT 分析,发现雄性 LysM - PLCβ4-/- 小鼠的小梁骨骨矿物质密度、骨体积与组织体积比、小梁骨数量显著增加,小梁骨分离度降低,而雌性小鼠无明显变化。组织学分析进一步证实雄性敲除小鼠骨量增加,破骨细胞数量减少,且骨形成参数无差异,表明靶向敲除破骨细胞谱系中的 PLCβ4 导致破骨细胞生成减少,进而增加骨量。

(六)PLCβ4 调节 RANKL 介导的 p38 磷酸化


刺激对照小鼠和 LysM - PLCβ4-/- 小鼠的血清饥饿 BMMs,免疫印迹分析显示,LysM - PLCβ4-/- 小鼠 BMMs 中 RANKL 刺激的 p38 激活被强烈阻断,p65 磷酸化也显著降低,而 IκBα、JNK 和 ERK 的磷酸化正常。M - CSF 和 TNF 刺激则不影响 PLCβ4 缺陷细胞中的 p38 磷酸化,表明 PLCβ4 在调节 RANKL 介导的 p38 信号通路激活中起重要作用。

(七)PLCβ4 与 MKK3 和 p38 形成复合物响应 RANKL


用 PLC 抑制剂 U73122 预处理对照 BMMs,发现其不影响 RANKL 诱导的 p38 磷酸化,说明 PLCβ4 的催化活性不是 p38 磷酸化所必需的。免疫沉淀实验表明,内源性 PLCβ4 与 p38 直接结合,RANKL 刺激增强了 PLCβ4 与 MKK3 的相互作用,并导致 p38 顺序招募到 PLCβ4 - MKK3 复合物中。免疫荧光分析证实了 RANKL 刺激后 PLCβ4 和 p38 在细胞内的共定位。

(八)激活 p38 通路挽救 PLCβ4 缺陷导致的破骨细胞生成受损


用 p38 激活剂茴香霉素预处理对照小鼠和 LysM - PLCβ4-/- 小鼠的 BMMs,再用 RANKL 刺激,结果显示茴香霉素恢复了 LysM - PLCβ4-/- 小鼠 BMMs 中降低的 p38 磷酸化水平,逆转了因 PLCβ4 缺失导致的破骨细胞形成减少。

四、研究结论


本研究表明,PLCβ4 是 RANKL 诱导的破骨细胞分化的关键调节因子。PLCβ4 通过与 MKK3 和 p38 MAPK 相互作用,调节 p38 的激活,进而促进破骨细胞生成。在体内,破骨细胞谱系特异性缺失 PLCβ4 的雄性小鼠骨量增加,破骨细胞数量减少,而骨形成不受影响。这一发现揭示了 PLCβ4 在维持骨稳态中的重要作用,为骨质疏松等以破骨细胞过度形成为特征的骨疾病的治疗提供了潜在的新靶点。

五、讨论


PLC 家族在维持细胞稳态和正常生理功能中起关键作用,其中 PLCγ2 在骨代谢中的作用已被广泛研究,但其他 PLC 同工酶在骨稳态中的功能大多未知。本研究首次明确了 PLCβ4 在调节 RANKL 介导的破骨细胞分化中的关键作用,表明除 PLCγ2 外,PLCβ4 也是骨稳态的重要调节因子。

研究发现 PLCβ4 缺陷的雄性和雌性小鼠在骨表型上存在性二态性,雄性小鼠小梁骨发生改变,而雌性小鼠无变化。这种差异可能与性激素对骨代谢的调节差异有关,但具体机制尚不清楚,有待进一步研究。

p38 MAPK 是 RANKL 介导的破骨细胞生成中 NFATc1 诱导的关键调节因子,是治疗骨质疏松的潜在靶点。本研究表明 PLCβ4 选择性促进 RANKL 介导的 p38 磷酸化,对破骨细胞分化至关重要。PLCβ4 通过与 MKK3 和 p38 形成复合物,激活 p38 和 p65,促进破骨细胞分化。且 PLCβ4 的催化活性并非 RANKL 介导的破骨细胞生成所必需。

该研究为理解骨代谢的分子机制提供了新视角,确定 PLCβ4 为骨疾病治疗的潜在靶点,有望为开发新型治疗策略提供理论依据,推动骨疾病治疗领域的发展。不过,目前仍有一些问题需要进一步研究,如 PLCβ4 在骨代谢中性别差异的具体机制,以及 PLCβ4 与其他信号通路的相互作用等,这些研究将有助于更深入地了解骨稳态的调控机制,为骨疾病的治疗提供更精准的方案。

相关新闻
生物通微信公众号
微信
新浪微博
  • 搜索
  • 国际
  • 国内
  • 人物
  • 产业
  • 热点
  • 科普
  • 急聘职位
  • 高薪职位

知名企业招聘

热点排行

    今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

    版权所有 生物通

    Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

    联系信箱:

    粤ICP备09063491号