高尔基体凝聚通过 HIF-1α 和 NEDD4 介导的 GM130 降解促进小肠脂质积累研究解读
韩国光州科学技术院生物医学科学与工程系的研究人员 Hyunsoo Kim 等人在《Experimental & Molecular Medicine》期刊上发表了题为 “Golgi condensation causes intestinal lipid accumulation through HIF-1α-mediated GM130 ubiquitination by NEDD4” 的论文。该研究揭示了高尔基体结构变化与小肠脂质积累之间的关联机制,为改善肥胖个体小肠脂质积累问题提供了潜在的干预靶点和理论依据,对深入理解代谢性疾病的发病机制具有重要意义。
研究背景
脂质在小肠中的转运主要涉及脂质的生成、包装以及以脂蛋白形式运输至其他组织的过程。高尔基体作为脂蛋白成熟的关键细胞器,其结构完整性对于脂蛋白从小肠上皮细胞的分泌至关重要。一旦脂蛋白成熟过程受阻,上皮细胞内就会出现脂质异常积累的现象。高尔基体的结构具有多样性,可分为扁平、分散和凝聚三种形态,其形态转变受到多种因素的精细调控 。
缺氧在体内可由血流量减少或低通气综合征引发,它能够通过多种机制影响高尔基体的功能,比如阻碍蛋白质从内质网向高尔基体的运输,进而导致高尔基体蛋白降解。缺氧诱导因子 1α(HIF-1α)作为缺氧应答的关键调节因子,对高尔基体功能有着显著影响。在肥胖相关的代谢紊乱中,缺氧与脂质代谢和运输密切相关,然而,目前关于缺氧条件下脂质运输过程中高尔基体的形态变化尚不清楚。
研究材料与方法
动物模型
选用 C57BL/6J 小鼠,在温度(22 ± 1 °C)和光照(12 h 光 - 暗循环)可控的环境中饲养,自由进食和饮水。将 8 周龄的小鼠随机分为两组,分别喂食含 10% 千卡脂肪的正常饲料(NCD)或含 60% 千卡脂肪的高脂肪饲料(HFD),持续 16 周以构建 HFD 喂养模型。从 HFD 喂养的第 6 周开始,对部分小鼠通过口服灌胃给予 HIF-1α 抑制剂 PX-478(10 mg/kg),每周 3 次。实验结束前,小鼠禁食 16 h,随后采集组织和血液样本进行后续检测。
细胞培养与体外实验
培养 RPE-1、Fhs74Int 和 Caco-2 等细胞系,分别使用相应的培养基,并添加 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素。利用 Transwell 系统构建细胞模型,通过在缺氧培养箱(1% O?和 5% CO?)中培养或使用氯化钴(CoCl?)、二甲基草酰甘氨酸(DMOG)处理细胞来模拟缺氧环境。采用油酸与牛血清白蛋白(BSA)缓冲液结合的方法诱导细胞吸收脂肪酸,并使用相关试剂盒检测细胞内游离脂肪酸的摄取情况。
转染实验
将特定的质粒和小干扰 RNA(siRNAs)与转染试剂混合,转染至细胞中,以调控基因的表达水平。实验中使用的质粒包括 p (HA) HIF1alpha(P402A,P564A)、p (HA) HIF1alpha(401delta603)R27G 等,siRNAs 用于干扰特定基因的表达,如 HIF-1α、NEDD4 等。
其他实验方法
运用 RNA 分离和实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测基因的 mRNA 表达水平;通过免疫荧光染色观察细胞内蛋白质的表达和定位情况,并利用相关软件分析免疫荧光强度、共定位系数以及高尔基体顺面膜囊的长度;采用蛋白质免疫印迹法(western blotting)检测蛋白质的表达水平;使用透射电子显微镜(TEM)观察细胞和组织的超微结构;通过 RNA 测序(RNA-seq)和蛋白质组学分析筛选相关基因和蛋白质;运用染色质免疫沉淀(ChIP)实验探究蛋白质与 DNA 的结合情况;采用油红 O 染色检测组织中的脂质积累;利用脂质提取和气相色谱 - 质谱联用(GC-MS)技术分析脂质成分。
研究技术路线
首先构建 HFD 喂养小鼠模型,检测小肠脂质含量、缺氧相关蛋白以及高尔基体蛋白的表达变化,以探究脂质积累与缺氧的关系。在细胞水平上,利用不同的细胞系,通过模拟缺氧环境、转染特定质粒和 siRNAs,研究 HIF-1α 对高尔基体形态变化的影响,以及 GM130 蛋白降解、NEDD4 的作用机制。通过一系列实验技术,如免疫荧光染色、western blotting、qRT-PCR 等,对相关指标进行检测和分析。最后,给予 HFD 喂养小鼠 PX-478 进行干预,观察其对高尔基体结构、脂质积累以及代谢指标的影响,从而验证相关机制在体内的作用。
研究结果
HFD 导致小肠脂质积累和缺氧
通过对 HFD 喂养小鼠的研究发现,与 NCD 喂养小鼠相比,HFD 喂养小鼠小肠脂质储存显著增加,PLIN2 表达上调。蛋白质组学分析显示,HFD 喂养小鼠中缺氧相关基因集以及脂肪酸代谢、糖酵解等代谢途径富集,同时多种 HIF 诱导蛋白表达上调,HIF-1α 蛋白及其靶基因 Bnip3 的表达也明显增加。此外,HFD 喂养小鼠的高尔基体蛋白表达显著降低,其中 GM130 蛋白表达下降尤为明显。这表明缺氧在 HFD 喂养小鼠小肠中同时诱导了脂质积累和高尔基体蛋白降解。
缺氧时高尔基体凝聚需要 HIF-1α 的转录激活
在 RPE-1 细胞中,研究人员发现暴露于三种不同的缺氧条件(1% 氧气的缺氧培养箱、CoCl?或 DMOG 处理)24 h 后,高尔基体发生凝聚,表现为顺 - 高尔基体顺面膜囊长度缩短。HIF-1α 缺失能够显著抑制缺氧诱导的高尔基体凝聚。随着缺氧时间延长,Hif-1α mRNA 表达增加,HIF-1α 蛋白从细胞质向细胞核的转位明显,其转录活性增强,靶基因 Bnip3 和 Ca-9 的表达上调。转染不同的 HIF-1α 突变体质粒实验进一步表明,HIF-1α 的转录活性对于缺氧条件下高尔基体凝聚至关重要。此外,干扰 Von Hippel-Lindau(VHL)基因促进 HIF-1α 蛋白稳定,进而诱导高尔基体凝聚,而干扰 HIF-2α 基因则不能阻止 CoCl?处理细胞中的高尔基体凝聚。
缺氧时 GM130 的蛋白酶体降解在高尔基体凝聚中起关键作用
在 CoCl?处理的细胞中,Golga2 mRNA 表达不受影响,但 GM130 蛋白水平下降,这种下降可被 siHIF-1α 逆转,表明 HIF-1α 缺失可阻止 GM130 降解。转染 HA - 泛素实验证实,CoCl?处理增加了 GM130 的泛素化水平,而 siHIF-1α 则显著降低其泛素化。使用蛋白酶体抑制剂 Velcade 处理,可抑制 CoCl?处理细胞中 GM130 的降解,并减弱 HA-HIF-1α(P402A/P564A)转染细胞中的高尔基体凝聚,说明 GM130 在缺氧条件下发生泛素化并经蛋白酶体降解,这一过程参与了 HIF-1α 介导的高尔基体凝聚。
E3 连接酶 NEDD4 在缺氧条件下降解高尔基体中的 GM130
分析 RNA-seq 数据发现,在缺氧条件下,E3 连接酶 NEDD4 的表达受 HIF-1α 调控。CoCl?处理细胞后,NEDD4 的 mRNA 和蛋白质表达水平均增加,HIF-1α 缺失可减弱这种变化。干扰 NEDD4 基因可减少 GM130 的泛素化,保护细胞免受 CoCl?诱导的高尔基体凝聚。转染具有不同 E3 连接酶活性的 NEDD4 突变体实验表明,NEDD4 在缺氧诱导的 GM130 降解和高尔基体凝聚过程中发挥关键作用。
缺氧条件下高尔基体凝聚导致小肠脂质积累
在 Fhs74Int 原发性小肠上皮细胞和 Caco-2 细胞中,研究发现缺氧诱导的高尔基体凝聚表现为 GM130 强度降低、BODIPY 强度增加,同时脂蛋白标记物载脂蛋白 A1(ApoA1)强度增加且在 ER 中滞留。干扰 HIF-1α 可抑制这些现象。此外,干扰 Golph3 基因增加了高尔基体凝聚、BODIPY 和 ApoA1 强度,降低了 GM130 表达,但其他脂质代谢相关蛋白的表达在对照组和 HIF-1α 缺失组之间无明显差异。这表明高尔基体凝聚在缺氧条件下促进小肠上皮细胞脂质积累并阻碍 ApoA1 向高尔基体的转运。
NEDD4 的酶活性对缺氧条件下肠上皮细胞脂质积累和 ApoA1 滞留至关重要
在 Fhs74Int 细胞中,干扰 NEDD4 基因可减少 CoCl?处理后的高尔基体凝聚、脂质积累和 ApoA1 滞留,维持高尔基体的线性结构。转染不同活性的 HIF-1α 和 NEDD4 突变体质粒实验表明,HIF-1α 和 NEDD4 的酶活性在高尔基体凝聚和脂质积累过程中起关键作用。分析发现,高尔基体凝聚导致 C16:0(棕榈酸)和 C18:2n6(亚油酸)等游离脂肪酸积累。过表达 GM130 可阻止高尔基体凝聚和脂质积累,进一步证明 GM130 在这一过程中的重要性。
GM130 缺失促进肠上皮细胞高尔基体凝聚和脂质积累
转染 siGolga2 降低 Fhs74Int 细胞中 GM130 表达后,细胞中高尔基体长度缩短,BODIPY 强度增加,且这种变化与 CoCl?处理无关,表明 GM130 缺失可促进高尔基体凝聚和脂质积累。
药物抑制 HIF-1α 可预防 HFD 喂养小鼠小肠 GM130 降解和脂质积累
给予 HFD 喂养小鼠 PX-478 处理后,小鼠小肠脂质储存减少,GM130 表达恢复,HIF-1α 和 PLIN2 表达降低。TEM 观察显示,PX-478 可防止 HFD 喂养小鼠小肠上皮细胞高尔基体凝聚和脂质积累。此外,PX-478 处理还减少了 ApoA1 在小肠中的滞留,增加了血清中 ApoB48 和 HDL 的水平,降低了 LDL 和 TG 的水平,改善了小鼠的代谢表型。这表明药物抑制 HIF-1α 不仅可防止 ApoA1 滞留,还能改善体内代谢状况。
研究结论与讨论
本研究表明,HIF-1α 是诱导 GM130 通过泛素化降解进而导致高尔基体凝聚的关键转录因子,在体内外实验中均引发了脂质积累。NEDD4 作为一种 E3 连接酶,在缺氧条件下对 GM130 的泛素化起着不可或缺的作用。抑制 HIF-1α 的激活可阻止高尔基体凝聚,促进脂质转运,对改善小肠脂质积累具有潜在的治疗效果。
在研究过程中,发现 HIF-1α 在高尔基体凝聚中的关键作用,而 HIF-2α 的作用不明显。尽管 HIF-1α 和 HIF-2α 结构相似,但在本研究中二者功能存在差异。同时,对于 GM130 与 NEDD4 相互作用的具体机制,推测可能存在未知的适配蛋白参与,但仍需进一步研究证实。
此外,本研究聚焦于高尔基体形态与脂质积累的关系,发现高尔基体凝聚会导致脂质转运和脂蛋白分泌功能受损,ApoA1 滞留增加。然而,关于缺氧或 HFD 条件下脂质吸收的研究相对较少,与其他研究结果存在差异,可能是由于 HIF-1α 对脂质吸收的影响或 GRASP55 的独特作用机制,这也为后续研究提供了方向。
总体而言,该研究揭示了高尔基体结构变化影响小肠脂质代谢的新机制,为治疗肥胖相关的小肠脂质积累疾病提供了新的靶点和理论基础,对深入理解代谢性疾病的发病机制和开发新的治疗策略具有重要的科学意义和潜在的临床应用价值。