通过丙酮酸脱氢酶激酶2缺乏增加氧化磷酸化改善手术诱导的骨关节炎小鼠软骨降解

【字体: 时间:2025年02月04日 来源:Experimental & Molecular Medicine 9.5

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丙酮酸脱氢酶激酶 2 缺陷增强氧化磷酸化改善小鼠骨关节炎中软骨退变研究解读


韩国庆北国立大学(Kyungpook National University)的 Jin Han、Yoon Hee Kim 和 Seungwoo Han 等研究人员在《Experimental & Molecular Medicine》期刊上发表了题为 “Increased oxidative phosphorylation through pyruvate dehydrogenase kinase 2 deficiency ameliorates cartilage degradation in mice with surgically induced osteoarthritis” 的论文。该研究揭示了丙酮酸脱氢酶激酶 2(PDK2)在骨关节炎(OA)发展中的关键作用,为 OA 的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略,在骨关节炎研究领域具有重要意义。

一、研究背景


骨关节炎(OA)是一种常见的退行性关节疾病,其特征为软骨细胞凋亡和软骨细胞外基质(ECM)降解,最终导致关节功能丧失。软骨组织中的软骨细胞能产生如 2 型胶原蛋白(Col2)和聚集蛋白聚糖等特异性 ECM 蛋白,并处于相对休眠状态。由于软骨是无血管组织,软骨细胞处于缺氧环境,主要依赖糖酵解供能,此时氧化磷酸化(OxPhos)产生的 ATP 不足细胞总量的 10%。

在 OA 早期的分解代谢状态下,软骨细胞展现出一定的代谢灵活性,可向 OxPhos 转变,以适应环境并维持生存和功能。然而,随着 OA 病情进展,线粒体功能障碍出现,软骨细胞的代谢适应性达到极限,逐渐转向糖酵解途径。这不仅使软骨细胞难以满足能量需求,还通过乳酸脱氢酶介导的方式加剧氧化应激,进一步恶化线粒体功能,最终导致软骨细胞凋亡和衰老。目前,虽然已知软骨细胞代谢失衡在 OA 发病机制中起关键作用,但引导软骨细胞代谢向 OxPhos 转变能否影响 OA 进展仍缺乏确凿证据。

葡萄糖经葡萄糖转运蛋白 1(GLUT1)和 GLUT3 进入软骨细胞后代谢生成丙酮酸,丙酮酸在线粒体中经丙酮酸脱氢酶(PDH)转化为乙酰辅酶 A(acetyl - CoA),连接细胞质糖酵解途径和线粒体三羧酸(TCA)循环。PDH 的活性是丙酮酸驱动的 OxPhos 的限速和关键调控因素,而丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)可通过磷酸化 PDH 的 α 亚基使其失活,从而调节 PDH 活性。PDK 有 4 种同工型(PDK1 - 4),其中 PDK2 广泛表达,但 PDKs 在软骨细胞中的表达及其在 OA 中的功能此前尚未得到深入研究。

二、研究材料与方法


(一)实验动物与细胞


实验使用 C57BL/6J 背景下基因敲除 PDK2 的小鼠(PDK2 KO),由庆北国立大学的 In - Kyu Lee 博士提供。从 5 日龄 C57BL/6J 小鼠的股骨和胫骨关节软骨中分离原代软骨细胞,用于后续实验。实验动物操作遵循美国国家研究委员会实验室动物护理和使用指南,并获得庆北国立大学医学院机构审查委员会批准(批准号 KNU 2022 - 0203)。

(二)RNA 和蛋白质表达分析


用 10 ng/ml 的 IL - 1β 处理原代软骨细胞,分别在 6 h 和 24 h 后提取 RNA 和蛋白质。提取总 RNA 后,通过逆转录生成 cDNA,利用实时荧光定量 PCR(qRT - PCR)检测目标基因表达,以 GAPDH 为内参,采用 2?ΔΔCT 法计算基因表达水平。提取总蛋白质后,经 SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转膜至聚偏二氟乙烯膜,用相应抗体进行免疫印迹检测,以 β - actin 作为内参,通过 ImageJ 软件对条带强度进行量化分析。

(三)手术诱导 OA 模型


选取 12 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠,包括 7 只 PDK2 KO 小鼠和 7 只同窝对照小鼠,在全身麻醉下通过手术破坏内侧半月板(DMM)诱导 OA,左侧膝关节进行假手术作为对照。术后将小鼠饲养于特定条件下,8 周后处死小鼠,收集膝关节用于组织学检查。实验遵循 ARRIVE 指南 2.0 进行。

(四)疼痛行为分析


术后 2 周开始,每周通过自发负重不对称试验(失能试验)、热板试验和阈值点状机械刺激试验(von Frey 试验)评估小鼠疼痛行为。分别测量小鼠后肢自发负重、热痛敏感性和触觉异常性疼痛,以此评估 OA 引起的疼痛程度。

(五)染色与检测


对小鼠膝关节进行 Safranin - O 染色和免疫荧光染色,评估软骨损伤程度并检测相关蛋白表达。利用 Seahorse XF96 细胞外通量分析仪分析软骨细胞代谢,分别检测线粒体呼吸和糖酵解功能。通过商业试剂盒检测细胞内 ATP 浓度和 NAD?/NADH 比值,用荧光染料检测细胞内活性氧(ROS)和线粒体 ROS 水平,通过免疫荧光染色评估氧化应激导致的 DNA 损伤,用 β - 半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。

(六)统计分析


实验数据以均值 ± 标准误(s.e.m.)表示,由于样本量较小且无法假定数据呈正态分布,采用非参数 Mann - Whitney U 检验比较两组数据的均值,P ≤ 0.05 认为具有统计学意义,使用 Prism 软件 8.0 进行统计分析。

三、研究结果


(一)PDK2 在 IL - 1β 诱导的分解代谢条件下及手术诱导的 OA 小鼠软骨中表达增加


通过 qRT - PCR 和蛋白质免疫印迹分析发现,IL - 1β 处理原代软骨细胞后,PDK2 和 PDK4 的 mRNA 水平升高,但只有 PDK2 的蛋白质水平显著增加,同时磷酸化 PDH 水平上升。在小鼠 DMM 手术诱导的 OA 模型中,术后 2 周磷酸化 PDH 和 PDK2 表达开始增加,且随时间持续上升,PDK4 在 8 周时虽有上升趋势但无统计学意义,PDK1 和 PDK3 则无明显变化。免疫荧光分析进一步证实了关节软骨中 MMP13 和 PDK2 表达的增加。

(二)PDK2 缺陷减轻 DMM 诱导的小鼠 OA 严重程度、氧化应激和疼痛相关行为


对比野生型(WT)和 PDK2 KO 小鼠的 DMM 诱导 OA 模型,发现 PDK2 基因缺失显著减缓了 OA 进展。通过 Safranin - O 染色和 OARSI 评分量化分析,发现 PDK2 KO 小鼠的软骨降解程度降低,骨赘成熟和软骨下骨厚度减少。免疫荧光染色显示,PDK2 KO 小鼠中 MMP13 阳性和 8 - oxo - dG 阳性软骨细胞数量减少,表明细胞外基质降解蛋白酶水平和氧化应激诱导的 DNA 损伤降低。从术后 6 周开始,PDK2 KO 小鼠在静态负重、热板试验和 von Frey 试验中表现出更少的疼痛相关行为。

(三)PDK2 缺陷部分恢复 IL - 1β 介导的软骨细胞向糖酵解的代谢转变


利用 Seahorse XF96 分析仪检测发现,IL - 1β 处理 24 h 显著抑制原代软骨细胞的 OxPhos,表现为氧消耗率(OCR)下降,同时增加糖酵解,表现为细胞外酸化率(ECAR)上升。PDK2 缺陷则部分恢复了 IL - 1β 处理条件下软骨细胞的 OCR,增加了基础呼吸和 ATP 生成,同时显著降低了 IL - 1β 介导的 ECAR 升高,减少了糖酵解和糖酵解能力。此外,PDK2 缺陷还导致 Pdk2 缺陷软骨细胞培养上清液中 ATP 含量和 NAD?/NADH 比值显著增加。

(四)PDK2 缺陷增强 PDH 活性和合成代谢作用,减少 IL - 1β 处理条件下软骨细胞的氧化应激和细胞衰老


在 IL - 1β 处理条件下,PDK2 缺陷增加了软骨生成标记基因 Col2 和 Aggrecan 的表达,降低了分解代谢蛋白酶 Mmp13 和 Il - 6 的表达,但对 Adamts5 和 Vegf 表达无影响。PDK2 缺陷增强了 PDH 酶活性,表现为磷酸化 PDH 水平降低。同时,PDK2 缺陷在 IL - 1β 处理的分解代谢条件下显著增加了 PDK1 和 PDK4 的蛋白质水平,且 Col2 蛋白水平增加,MMP13 蛋白水平降低,抗氧化蛋白 NRF2 和 HO - 1 水平上升。此外,PDK2 缺陷的软骨细胞在 IL - 1β 处理后,ROS 和 8 - oxo - dG 生成显著减少,衰老相关 β - 半乳糖苷酶(SA - β - gal)表达降低,表明氧化应激和细胞衰老程度减轻。

(五)PDK2 缺陷降低 p38 信号活性并维持 IL - 1β 刺激下 AMPK 的激活


研究人员检测了代谢和氧化应激相关信号通路,发现与 WT 软骨细胞相比,PDK2 缺陷的软骨细胞中 p38 MAPK(Thr180/Tyr182)的磷酸化水平显著抑制,而通常被 IL - 1β 刺激下调的 AMPK(Thr172)磷酸化在 PDK2 缺失的软骨细胞中保持激活状态。PDK2 缺陷导致 FoxO3a(Ser253)在 IL - 1β 刺激后 5 和 60 min 的磷酸化呈不连续增加,抑制了 FoxO3a 活性,而 mTOR、JNK、p65 和 AKT 信号的激活不受 PDK2 缺陷影响。

(六)p38 MAPK 在 PDK2 缺陷条件下对 ROS 生成和细胞衰老的作用


用 p38 抑制剂 SB203580 和线粒体超氧化物特异性清除剂 Mito - TEMPO 处理 WT 和 PDK2 缺陷的软骨细胞。结果显示,抑制 p38 显著抑制 WT 软骨细胞中 ROS 生成和细胞衰老,但在 PDK2 缺陷的软骨细胞中,ROS 生成和细胞衰老不受影响。此外,清除线粒体超氧化物显著降低了 WT 和 PDK2 缺陷软骨细胞中 p38 MAPK 的磷酸化水平,表明线粒体 ROS 对 p38 激活至关重要,且在 PDK2 缺陷导致 OxPhos 增加的代谢环境中,p38 MAPK 在 ROS 生成和细胞衰老中不起显著作用。

四、研究结论与讨论


研究表明,PDK2 在 OA 软骨细胞中特异性上调,其功能缺失可增加 PDH 活性,恢复 IL - 1β 介导的软骨细胞向糖酵解的代谢转变,增强 OxPhos。在手术诱导的 OA 模型中,PDK2 缺陷具有保护作用,可减轻氧化应激和细胞衰老,减缓 OA 进展。机制上,PDK2 缺陷导致 p38 MAPK 激活减少,同时维持 IL - 1β 处理条件下 AMPK 信号的激活。

线粒体功能障碍在 OA 发病机制中起关键作用。随着 OA 进展,软骨细胞线粒体呼吸链功能下降,线粒体数量减少且裂变增加,导致线粒体功能障碍,进而影响 ATP 生成并增加氧化应激。本研究中,PDK2 缺陷增加 OxPhos 却减少了氧化应激,这与传统观点中增加 OxPhos 会增加 ROS 的认知相悖。但已有研究表明,线粒体呼吸过度或缺陷均可能导致 ROS 增加,本研究体外实验也发现,在不同细胞状态下,促进 OxPhos 对 ROS 的影响不同,在衰老或应激条件下,增加 OxPhos 可能减少 ROS 生成,提示恢复 OA 软骨细胞的 OxPhos 有望抑制 OA 进展。

目前,OA 软骨细胞向糖酵解代谢转变的分子机制尚不完全清楚。本研究发现 PDK2 在分解代谢条件下显著增加,PDK2 缺陷可减少 PDH 磷酸化,增强 OxPhos 并减少糖酵解,表明 PDK2 可能是软骨细胞代谢的关键调节因子。此外,PDK2 在软骨细胞中的表达具有特异性,在分解代谢软骨细胞和体内 OA 软骨中表达增加,而在正常软骨生理中作用有限,这使得靶向 PDK2 治疗 OA 时对正常软骨生理影响较小,为 OA 药物开发提供了潜在优势。

本研究还发现,PDK2 缺陷显著降低 IL - 1β 介导的 p38 MAPK 磷酸化,p38 MAPK 可能是 OA 软骨中连接代谢改变和炎症基因表达的重要中介。同时,PDK2 缺陷减缓了 IL - 1β 刺激下 AMPK 磷酸化的降低,有助于维持软骨细胞在分解代谢条件下的代谢稳态。

总体而言,本研究揭示了 PDK2 在 OA 发展中的关键作用,为 OA 治疗提供了新的潜在靶点,即通过调节 PDK2 促进软骨细胞代谢向 OxPhos 转变,有望成为治疗 OA 的有效策略,对推动 OA 治疗研究具有重要意义。未来研究可进一步探索 PDK2 作为治疗靶点的可行性和安全性,以及相关信号通路的具体调控机制,为开发更有效的 OA 治疗方法奠定基础。

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