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功能核糖体亚基的组装是由专门的组装因子辅助的。在这里,作者发现Reh1位于80S核糖体的多肽出口通道中,这表明在第一轮翻译过程中,生长的多肽链取代了Reh1。
探秘核糖体组装因子 Reh1:翻译起始后的 “隐藏守护者”
在细胞的微观世界里,蛋白质合成是维持生命活动的核心环节,而核糖体作为蛋白质合成的关键 “工厂”,其组装和功能发挥一直是生物学研究的热点领域。美国得克萨斯大学奥斯汀分校分子生物科学系的研究人员在《Nature Communications》杂志上发表了题为 “The assembly factor Reh1 is released from the ribosome during its initial round of translation” 的论文,这一研究成果为理解核糖体的组装机制带来了新的突破,对深入探究细胞内蛋白质合成的精细调控过程具有重要意义。
一、研究背景
在真核细胞中,核糖体的合成是一个复杂且高度有序的过程。这一过程起始于核仁,rRNA 转录与早期加工折叠在核仁内完成后,前 40S 和前 60S 亚基被释放到核质中,随后分别转运至细胞质。虽然这些新生亚基在核输出前已基本完成组装,但在细胞质中仍需经历关键的成熟步骤,才能成为具备翻译功能的核糖体亚基。
在细胞质中,前 60S 亚基的成熟遵循特定的层级路径,多种组装因子参与其中。在多肽出口通道(PET)处,蛋白质会发生一系列的交换。例如,Nog1 的 C 端与 Rlp24 相互缠绕,Rlp24 的释放会使 Nog1 从 PET 中脱离,随后 Rei1 结合到亚基上,其 C 端也插入到出口通道中。与此同时,肽基转移酶中心(PTC)的组装也在进行,uL16 的插入促使 Nmd3 从 P 和 E 位点释放,进而使 Sdo1 得以结合,激活 GTPase Efl1,释放 Tif6,为核糖体的翻译 “解锁”。
此前,研究认为 Tif6 的释放是 60S 亚基成熟的最后一步,释放后的核糖体可进入翻译池。然而,对于 Reh1 这一核糖体组装因子的释放时间和机制,科学界尚未明确。Reh1 作为 Rei1 的旁系同源物,在 Rei1 释放后与前 60S 亚基结合,其 C 端同样插入到出口通道中。基于此,本研究聚焦于 Reh1,旨在揭示其在核糖体组装和翻译过程中的具体作用机制。
二、研究材料与方法
(一)实验菌株与质粒构建
研究人员构建了多种酵母菌株,包括 AJY4049、AJY3027 等,并通过一系列分子生物学技术对菌株进行改造,如基因敲除、定点突变和荧光标记等。同时,构建了众多用于实验的质粒,像 pAJ4155、pAJ4156 等,这些质粒携带不同的基因片段或标签,为后续的实验操作提供了便利。
(二)蛋白纯化与 GTPase 活性检测
在蛋白纯化方面,以表达和纯化 Reh1 为例,将携带相应质粒的大肠杆菌在特定培养基中培养,当菌液 OD600 达到 0.4 时,通过降温并添加 IPTG 诱导蛋白表达。随后,经过细胞破碎、离心、NiNTA 树脂和 amylose 树脂亲和层析等多步纯化,最终获得高纯度的 Reh1 蛋白。对于 Efl1、Sdo1 和 60S 亚基等蛋白,也采用了相应的纯化方法。在 GTPase 活性检测实验中,将不同组合的蛋白与 GTP 在特定反应缓冲液中混合,反应结束后通过薄层层析和放射自显影技术检测 GDP 的生成量,以此来评估 Efl1 的 GTPase 活性。
(三)蔗糖密度梯度离心与荧光显微镜观察
蔗糖密度梯度离心实验用于分析蛋白在不同核糖体组分中的沉降分布。具体操作是将细胞培养至合适的生长阶段,添加 β - 雌二醇诱导蛋白表达,再加入环己酰亚胺抑制核糖体移动,随后制备细胞裂解液并加载到蔗糖密度梯度上进行超速离心。离心结束后,收集不同梯度的组分,通过 SDS - PAGE 和 Western blot 分析其中蛋白的含量和分布。在荧光显微镜观察实验中,将细胞固定、染色后,使用尼康 E800 显微镜搭配特定的相机和软件,对细胞内荧光信号进行成像,以此观察相关蛋白的细胞定位情况。
(四)核糖体分析技术
核糖体分析技术包括核糖体图谱分析和 tRNA 富集分析。在核糖体图谱分析中,先培养携带特定质粒的酵母细胞,收集细胞后制备裂解液,用 RNase I 消化 RNA,再通过免疫沉淀富集与 Reh1 结合的核糖体,对其 RNA 进行提取、片段选择和文库构建,最终进行高通量测序和数据分析。tRNA 富集分析则是通过对细胞裂解液进行 RNase I 消化、免疫沉淀、RNA 提取等操作,然后利用 Northern blotting 技术,使用针对不同 tRNA 的放射性标记探针,检测 tRNA 在不同样本中的富集情况。
(五)冷冻电镜数据收集与处理
研究人员通过亲和纯化获取与 Reh1 结合的核糖体,将其制备成样本后应用于 Quantifoil R1.2/1.3 网格。使用 Titan Krios 显微镜在特定条件下收集冷冻电镜数据,利用 cryoSPARC 软件进行数据处理,包括运动校正、CTF 估计、粒子挑选和分类等步骤,最终得到不同状态下的核糖体结构模型。
三、研究结果
(一)Reh1 与游离 60S 亚基及多聚核糖体共沉降
研究人员通过监测 Reh1 在蔗糖密度梯度中的沉降情况发现,与仅和游离 60S 亚基共沉降的 Nmd3 和 Tif6 不同,瞬时表达的 FLAG 标记的 Reh1 不仅存在于游离 60S 亚基的组分中,还出现在多聚核糖体的组分里。内源性表达的 Reh1 同样如此,且在翻译起始受葡萄糖耗尽抑制时,会从多聚核糖体组分转移到游离 60S 亚基组分。这表明 Reh1 在亚基结合后仍会持续存在于 60S 亚基上,意味着其释放时间晚于 Tif6。
(二)Reh1 经生物合成途径进入多聚核糖体
为探究 Reh1 进入多聚核糖体的途径,研究人员构建了 Reh1 突变体。通过在 Reh1 的 C 端延伸来自 Sdo1 的不同长度的氨基酸序列,发现延伸 6 个或 10 个氨基酸的突变体(Reh1 + 6 和 Reh1 + 10)在过表达时具有显性负效应,会阻碍新生 60S 亚基进入活跃翻译核糖体池。其中,Reh1 + 6 主要富集在 pre - 60S 组分中,几乎不存在于 80S 和多聚核糖体组分中,这有力地支持了野生型 Reh1 是通过生物合成途径进入多聚核糖体的结论。
(三)Reh1 的显性突变体阻断 Nmd3 和 Tif6 的释放
实验表明,Reh1 + 6 能够剂量依赖性地抑制 Efl1 的 GTPase 活性。在体内实验中,过表达 Reh1 + 6 会强烈抑制 Tif6 和 Nmd3 - L505A 的核循环,但对 Nog1、Arx1 和 Mrt4 的循环没有影响,这说明 Reh1 + 6 特异性地阻断了 60S 亚基组装的晚期步骤。此外,当与 TIF6 - V192F(一种降低 Tif6 与前 60S 亚基亲和力的突变体)共表达时,Reh1 + 6 的显性负生长效应得到缓解,且含有 Reh1 + 6 的 60S 亚基能够进入多聚核糖体,进一步证明 Reh1 的释放发生在 Tif6 之后。
(四)Reh1 的 C 端对其功能和与 60S 亚基的结合至关重要
通过构建 Reh1 的 C 端截断突变体,研究人员发现去除 43 个氨基酸的 Reh1Δ43 与核糖体的结合能力显著受损,而去除 6 个氨基酸的 Reh1Δ6 仍能保留一定的结合能力。在互补实验中,无论是 Reh1Δ6 还是 Reh1Δ43,都无法挽救 REH1 缺失导致的功能缺陷,这表明 Reh1 的功能对其 C 端与前 60S 亚基的结合依赖性较强,且这种依赖性比 Rei1 更高。
(五)Reh1 结合核糖体的选择性核糖体图谱分析
利用选择性核糖体图谱分析技术,研究人员发现 Reh1 结合核糖体的足迹主要分布在开放阅读框(ORF)起始密码子附近约 75 个核苷酸内,且在终止密码子处也有较强信号。对 Reh1Δ6 进行同样的分析发现,其结合核糖体的足迹在编码序列中持续的深度更深,这与新生多肽链在翻译早期排挤 Reh1 的模型相符,同时也表明新生多肽链的净电荷与 Reh1 结合核糖体足迹的富集存在一定关联,净正电荷的新生多肽会略微增加 Reh1 的停留时间。
(六)Reh1 颗粒富含起始 tRNA
研究人员通过检测发现,与总输入 RNA 和 RNase I 处理后的提取物相比,含有 Reh1 的核糖体中起始 tRNA(
)的含量显著富集。这一结果与核糖体图谱分析结果一致,进一步表明 Reh1 结合的核糖体富含起始 80S 核糖体,暗示 Reh1 在翻译起始阶段发挥着重要作用。
(七)Reh1 - 80S 复合物的冷冻电镜结构
研究人员解析了 Reh1 - 80S 复合物的 3.1 ? 冷冻电镜结构,发现 Reh1 的 C 端 57 个氨基酸几乎占据了整个出口通道,且其构象与之前在 pre - 60S 亚基中观察到的相似。在近一半含有 mRNA 和 tRNA 的 80S 颗粒中,还存在翻译延伸因子 eIF5A。虽然 eIF5A 的存在并不影响 Reh1 的释放,但它与核糖体的动态变化有关。此外,结构中还发现 eS25 的 N 端插入到 A 和 P 位点 tRNA 之间,这一相互作用可能在翻译起始的早期阶段发挥特定作用。
四、研究结论与讨论
本研究明确了 Reh1 在核糖体组装和翻译过程中的重要作用。研究结论表明,Reh1 是 60S 亚基成熟的最后一个组装因子,其释放发生在亚基结合后的翻译起始阶段,且很可能是由新生多肽链将其从 PET 中排挤出去。
在讨论部分,研究成果的意义进一步凸显。这一发现加深了科学界对细胞质中前 60S 亚基成熟过程的理解,揭示了 Reh1 在核糖体初始翻译轮次中的独特标记作用。同时,研究还提出了关于 Reh1 功能的两种假设:一是 Reh1 可能防止小分子或多肽在核糖体翻译前堵塞出口通道;二是 Reh1 可能监测新组装核糖体的功能,若核糖体存在缺陷,Reh1 的持续存在可能会将其标记并引导至质量控制或降解途径。
此外,研究还对不同物种中 Rei1 和 Reh1 的同源物进行了探讨。大多数真核物种仅表达一种 Rei1 - 样蛋白,如人类的 ZNF622。酵母和十字花科植物是例外,它们表达两种 Rei1 - 样蛋白。研究推测,在存在 Reh1 旁系同源物的情况下,Reh1 可能通过更高的亲和力取代 Rei1 与缺少 Arx1 的前 60S 亚基结合,而 Tif6 的释放可能促使 Reh1 的释放,并阻止其与游离 60S 亚基重新结合。在人类细胞中,ZNF622 的水平依赖于泛素 E3 连接酶 HECTD1,缺乏 HECTD1 时,ZNF622 和 eIF6 会在 60S 亚基上积累,这表明 ZNF622 更可能是 Rei1 的功能同源物,而非 Reh1。
美国得克萨斯大学奥斯汀分校研究人员的这项研究,通过一系列严谨的实验,对核糖体组装因子 Reh1 进行了深入探究,为核糖体生物学领域提供了关键的理论依据,也为后续研究核糖体的功能和蛋白质合成机制奠定了坚实基础,其成果对于理解细胞内复杂的生命活动具有重要的推动作用。