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真核翻译延伸因子 1A（eEF1A）对细胞十分重要，但其共翻译折叠机制不明。研究人员开展了 eEF1A 共翻译折叠机制的研究，发现 Ypl225w 可介导 eEF1A 新生链折叠。该成果揭示了新的折叠机制，为相关领域研究提供了关键线索。
在细胞的微观世界里，蛋白质的正确折叠如同精密机器的零件组装，至关重要。真核翻译延伸因子 1A（eEF1A）是细胞内一种含量丰富且功能关键的多结构域 GTP 酶，它在蛋白质合成过程中负责将携带氨基酸的转运核糖核酸（tRNA）精准地送到正在翻译的核糖体上，确保蛋白质的合成顺利进行。然而，eEF1A 在合成后的折叠过程却隐藏着诸多奥秘。
目前已知，蛋白质折叠需要分子伴侣的协助，在真核生物中，热休克蛋白 70（Hsp70）及其共伴侣、Hsp90 系统和 TRiC/CCT 伴侣蛋白在蛋白质折叠中发挥着重要作用。但对于 eEF1A 这种特殊的蛋白质，其共翻译（即蛋白质在核糖体上合成的同时进行折叠）阶段的折叠机制却鲜为人知。此前研究发现，原核生物中存在一种核糖体结合的、不依赖 ATP 的分子伴侣 Trigger Factor，它能抑制原核 GTP 酶 EF - G 的共翻译错误折叠。由于 EF - G 与 eEF1A 在结构和序列上有相似之处，研究人员不禁猜测，在真核生物中是否也存在类似的分子伴侣，参与 eEF1A 的共翻译折叠过程呢？这一疑问促使来自哈佛大学（Harvard University）等机构的研究人员展开了深入研究。
研究人员的发现意义重大。他们揭示了一种全新的 eEF1A 共翻译折叠机制，为理解细胞内蛋白质合成与折叠的调控网络提供了关键信息。这不仅有助于深入了解细胞的基本生命过程，还可能为开发针对相关疾病的治疗策略提供理论基础。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为生命科学领域的研究开辟了新的方向。
为了开展这项研究，研究人员使用了多种关键技术方法。在筛选潜在的 eEF1A 分子伴侣时，运用了 AlphaPulldown 技术（一种基于 AlphaFold 的筛选方法），通过生物信息学分析预测蛋白质之间的相互作用。在验证 Ypl225w 与 eEF1A 的相互作用及功能时，采用了体外翻译系统、免疫沉淀、质谱分析等实验技术。此外，还利用计算模拟方法，如 Monte Carlo 模拟，预测 eEF1A 在不同折叠阶段的构象变化。
下面来详细看看研究结果：
- 计算建模确定 Ypl225w 为 eEF1A 分子伴侣候选：研究人员运用 AlphaPulldown 技术，以 eEF1A 的序列为诱饵，在酵母蛋白质库中进行筛选，发现 Ypl225w 是潜在的 eEF1A 分子伴侣。通过 ColabFold 建模显示，Ypl225w 的 N 端 α 螺旋（NaH）可稳定 eEF1A 的 GTP 结合结构域（DI）的非天然构象。同时，计算模拟表明，eEF1A 与 Ypl225w 相互作用的区域（氨基酸 1 - 72）容易形成错误折叠的中间体，而 Ypl225w 可能在氨基酸 72 - 95 的核糖体出现窗口与 eEF1A 新生链结合。
- ypl225wΔ 细胞显示 eEF1A 生物发生缺陷的特征：研究人员发现，ypl225w 基因缺失的细胞表现出 eEF1A 生物发生缺陷的迹象，如基础 Hsf1 活性升高、eEF1A - GFP 聚集以及 eEF1A 蛋白水平下降。当与非诱导型的 hsf1 等位基因结合时，ypl225wΔ 细胞出现严重的生长缺陷，这表明 Ypl225w 在维持 eEF1A 的蛋白质稳态中起着重要作用。
- Ypl225w 是真正的 eEF1A 分子伴侣：体外翻译实验表明，Ypl225w 缺失的提取物中合成的 eEF1A 对胰蛋白酶的抗性显著降低，而添加重组 Ypl225w - 3xFLAG 可恢复 eEF1A 的折叠，证明 Ypl225w 是真正的 eEF1A 分子伴侣。
- Ypl225w 与翻译中的核糖体相关：免疫沉淀和质谱分析发现，Ypl225w 与核糖体亚基蛋白相互作用。蔗糖梯度离心实验进一步证实，Ypl225w 存在于含有多聚核糖体的重组分中，表明其与翻译中的核糖体相关。
- Ypl225w 是 eEF1A 的 GTP 结合结构域的共翻译分子伴侣：研究人员通过比较野生型和 ypl225wΔ 细胞中 eEF1A DI - GFP 的表达情况，发现 ypl225wΔ 细胞中 eEF1A DI 出现聚集和降解现象。同时，体外交联实验表明，Ypl225w 与 eEF1A DI 的新生链相互作用，但不与含有 DII 的更长新生链相互作用，说明 Ypl225w 特异性地作用于 eEF1A DI 的共翻译折叠。
- NAC 通过核糖体招募 Ypl225w 促进 eEF1A 体外折叠：研究发现，NAC 的 UBA 结构域与 Ypl225w 相互作用，且这种相互作用对于 Ypl225w 结合到核糖体并促进 eEF1A 折叠至关重要。egd2Δ 细胞提取物中 eEF1A 出现严重错误折叠，而添加野生型 NAC 可恢复其折叠，表明 NAC 通过招募 Ypl225w 促进 eEF1A 的共翻译折叠。
- Ypl225w 利用其 N 端 α 螺旋的疏水补丁介导 eEF1A 折叠：研究人员对 Ypl225w 的 NaH 上的疏水补丁进行突变（F19A），发现突变后的 Ypl225w 失去了分子伴侣功能，无法与 eEF1A 结合，也不能促进 eEF1A 的折叠，说明 NaH 的疏水补丁在 Ypl225w 与 eEF1A 的相互作用及折叠促进中起关键作用。
- GTP 结合到 eEF1A 驱动 Ypl225w 循环：研究表明，GTP 结合到 eEF1A 的 DI 结构域可导致 Ypl225w 从 eEF1A 新生链上释放。通过生物膜干涉技术（BLI）等实验，验证了 GTP 能够主动促进 Ypl225w 与 eEF1A DI 的解离，从而驱动 Ypl225w 在 eEF1A 共翻译折叠过程中的循环。
研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了一种由 NAC 介导的、Ypl225w 参与的 eEF1A 共翻译折叠机制。在这一机制中，NAC 通过其 UBA 结构域招募 Ypl225w 到核糖体，Ypl225w 利用其 NaH 稳定 eEF1A DI 的新生链，使其处于易于结合 GTP 的状态。当 GTP 结合到 eEF1A DI 时，Ypl225w 释放，eEF1A DI 折叠，完成共翻译折叠过程。这一机制与原核生物中 Trigger Factor 介导的蛋白质折叠机制以及真核生物中 Ric8 介导的 G 蛋白折叠机制有相似之处，都体现了 ATP 非依赖型分子伴侣利用客户蛋白的核苷酸结合来促进折叠的特点。此外，研究还发现 Ypl225w 的功能在不同酵母物种中具有保守性，并且在其他生物中也存在类似的相互作用，这表明该研究揭示的机制可能具有广泛的生物学意义。未来的研究可以进一步探索 eEF1A 依赖这种共翻译折叠机制的进化起源，以及 NAC 在维持蛋白质稳态中的具体作用机制。总之，这项研究为深入理解蛋白质共翻译折叠的分子机制提供了重要的理论依据，为相关领域的研究奠定了坚实的基础。
