空间转录组学鉴定与肺纤维化远端肺重构相关的分子生态位失调

【字体: 时间:2025年02月04日 来源:Nature Genetics 31.8

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  肺纤维化的Xenium空间转录组谱表征了与该疾病相关的细胞组成动力学和组织病理学特征。

  

空间转录组学揭示肺纤维化远端肺重塑相关分子生态位失调


在肺部疾病研究领域,肺纤维化(PF)的发病机制一直是研究的重点与难点。近日,来自 Translational Genomics Research Institute 的 Annika Vannan、Ruqian Lyu 等研究人员在Nature Genetics杂志上发表了题为 “Spatial transcriptomics identifies molecular niche dysregulation associated with distal lung remodeling in pulmonary fibrosis” 的论文。这一研究成果意义重大,通过空间转录组学技术,为深入理解肺纤维化的发病机制提供了全新视角,也为后续精准治疗策略的制定奠定了坚实基础。

一、研究背景


肺纤维化是一种渐进性的严重肺部疾病,其中特发性肺纤维化(IPF)最为常见且严重。大部分 IPF 患者在确诊后的 3 - 5 年内,要么病情恶化,要么需要进行肺移植,而现有的抗纤维化治疗手段只能在一定程度上延缓肺功能的下降,无法从根本上治愈疾病。

IPF 患者肺部的病理特征呈现出明显的空间异质性,即广泛重塑的区域与相对保留的肺泡结构相邻。同时,还存在近端化上皮化生、囊性结构(蜂窝囊肿)形成以及成纤维细胞灶出现等特征。这些特征支持了当前关于 IPF 发病机制的主流模型,即远端肺上皮的慢性或反复损伤会导致肺泡修复功能障碍,最终引发进行性纤维化重塑。

以往的单细胞 RNA 测序(scRNA - seq)研究虽然对正常人类肺的细胞组成以及 IPF 肺部细胞和分子程序的变化有了更深入的了解,但由于疾病的细胞复杂性和空间异质性,利用批量组织方法进行基因组分析存在一定的局限性。因此,探究细胞和分子程序在疾病发病机制中的空间背景至关重要,而基于图像的空间转录组学技术为解决这一问题提供了可能。

二、研究材料与方法


(一)研究材料


研究样本包括来自 9 名未受影响的器官捐赠者的肺组织样本,以及 26 名因 PF 接受肺移植患者的肺组织样本。样本均经过福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)处理。

(二)关键技术路线


  1. 组织微阵列(TMA)构建:为提高实验效率,将多个样本制作成 TMA。先对 FFPE 肺组织块进行苏木精 - 伊红(H&E)染色,由医生标记感兴趣区域,然后手动打孔取样并制作 TMA,TMA 制作完成后进行存储。
  2. Xenium 原位工作流程:设计包含 343 个基因的定制基因面板,涵盖早期 Xenium 人类肺基础面板和自定义面板的基因。对样本进行 RNA 处理、探针杂交、连接和滚环扩增等操作,利用 Xenium Analyzer 仪器进行数据采集,最后进行 H&E 染色和图像采集。
  3. 数据预处理:通过细胞分割、图像配准、质量过滤和数据预处理等步骤,对 Xenium 数据进行处理。利用 Scanpy 和 Seurat 等工具进行降维、聚类和细胞类型注释,最终确定 47 种细胞类型。
  4. 计算生态位识别:采用基于细胞的方法(Seurat v5)和基于转录本的方法(GraphSAGE)对样本进行分区,识别空间 “生态位”。基于转录本的方法通过训练图神经网络模型,对转录本进行聚类分析,确定生态位。
  5. 其他分析方法:进行细胞类型邻近分析、差异表达和组成分析、管腔分割和空域识别等分析,以探究细胞类型、生态位和基因表达在疾病进程中的变化。

三、研究结果


(一)肺的多样细胞景观


研究人员利用 Xenium 平台对 45 个肺组织样本进行分析,测量了 299,018,086 个转录本,并通过自动细胞分割边界将转录本分配到细胞中。经过质量过滤后,保留了 1,630,319 个细胞和 121,794,939 个转录本。通过分析,共鉴定出 47 种细胞类型,包括在 scRNA - seq 研究中代表性不足的内皮细胞和间充质细胞等,更准确地反映了疾病状态下肺的细胞组成。例如,通过空间转录组学分析,未受影响样本中肺泡 2 型(AT2)与肺泡 1 型(AT1)细胞的平均比例为 2.5,比 scRNA - seq 研究中的比例(13.2)更接近预期。此外,研究还确定了多种细胞类型在肺内的空间位置,如基底细胞和多纤毛细胞在气道中的特定位置,以及不同亚型的成纤维细胞在肺内的分布等。

(二)生态位分析揭示疾病相关的细胞相互作用


通过两种互补的计算方法,研究人员将样本划分为具有分子和细胞相似性的区域(即空间 “生态位”)。基于细胞的方法和基于转录本的方法均鉴定出 12 个生态位,这些生态位具有不同的基因表达特征和细胞类型组成。研究发现,健康肺泡生态位在未受影响的样本中占主导地位,而在 PF 样本中相对丰度显著降低;许多生态位在疾病状态下出现或富集,如免疫生态位、纤维化生态位和过渡上皮生态位等。例如,富含淋巴细胞炎症的生态位在更严重重塑的样本中更为普遍,暗示其在疾病后期发病机制中的作用。同时,研究还发现 PF 肺部轻度重塑区域的生态位组成更接近严重重塑区域,而非正常肺组织,这表明即使在结构相对保留的区域,也存在广泛的分子病理变化。此外,研究人员还发现上皮脱离与特定的生态位(T3 和 C3)密切相关,这些生态位包含大量的 KRT5?/KRT17 + 细胞和活化的成纤维细胞。通过验证实验,进一步证实了空间转录组数据在识别特定疾病相关病理特征方面的潜力。

(三)疾病相关巨噬细胞在肺泡内积累


研究发现了一个与巨噬细胞在肺泡内积累相关的细胞基础生态位(C11),该生态位在所有疾病样本中均存在。肺泡内积累的巨噬细胞包括以 FABP4 和 SPP1 标记的两个主要群体。在 PF 样本中,随着肺泡重塑程度的增加,FABP4 + 巨噬细胞在总巨噬细胞群体中的比例先略微增加,随后减少;而 SPP1 + 巨噬细胞在更严重受影响的样本中占总巨噬细胞群体的比例更高,且其表达增加与更高的病理评分相关。这表明巨噬细胞表型的演变是 PF 进展的特征之一。

(四)肺泡失调的时间线


研究人员开发了一种机器学习方法,基于转录本表达的空间模式识别和分割肺泡腔,并根据健康肺泡转录本生态位 T4 的比例对肺泡进行排序。通过这种方法,确定了基因表达、细胞类型组成和生态位比例与疾病严重程度(伪时间)的关系。研究发现,肺泡稳态的初始丧失表现为毛细血管内皮细胞和 AT1 细胞的丢失,随后增殖的 AT2 细胞数量增加,之后随着上皮向过渡和终末气道型特征转变,其频率降低。活化的成纤维细胞在向更气道样上皮转变时出现,而 FABP4 + 和 SPP1 + 巨噬细胞的积累是后期事件。此外,研究还发现分子病理变化在肺泡上皮中早于广泛的结构重塑出现,支持了上皮损伤和失调是 PF 风险和疾病起始的核心这一概念。

四、研究结论与讨论


本研究通过空间转录组学技术,对健康和慢性纤维化肺疾病中成人远端肺的细胞多样性进行了全面的单细胞分辨率和空间背景下的表征。研究不仅确定了 PF 经典组织病理学特征的分子基础,还发现了 KRT5?/KRT17 + 细胞从基底膜脱离的现象,这一现象在体内的发生机制虽仍存在争议,但研究结果表明其不太可能是随机的体外假象。同时,研究证实了人体肺中存在可定义的空间 “生态位”,且这些生态位在疾病过程中发生了显著变化,即使在纤维化肺相对保留的区域,也存在大量分子病理变化,这为理解 PF 发病机制提供了新的视角。

此外,研究通过对单个肺泡的分析,揭示了肺泡重塑的分子演变过程,发现肺泡上皮和相邻毛细血管网络的破坏先于其他结构重塑,而活化的成纤维细胞和巨噬细胞的积累是后期事件。这一发现对于制定精准治疗策略具有重要意义,提示在治疗过程中需要同时评估个体在特定时间最突出的细胞机制,以便更好地使治疗方法与患者的疾病生物学相匹配,提高治疗效果并减少毒性。

然而,本研究也存在一些局限性。样本数量相对较少,且主要来自器官捐赠者或终末期疾病患者,参与者大多为欧洲血统,这可能限制了研究结果的普遍性。基于成像的空间转录组学平台本身具有半靶向性,细胞分割在肺部等器官中仍然是一个挑战,尽管采取了一些措施,但仍存在转录本 “污染” 的问题,需要新的计算方法来解决。

总体而言,该研究为肺纤维化的研究提供了丰富的信息,其发现的空间生态位及其在疾病中的演变,为深入理解 PF 发病机制提供了重要依据,开发的新分析方法也为肺生物学领域的研究提供了有价值的资源,有望推动肺纤维化治疗策略的进一步发展。

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