Usp11 在电离辐射下对边缘区 B 细胞存活的调控作用研究解读
苏州大学附属第一医院、苏州大学放射医学与防护学院等单位的 Jiaqi Sheng、Depei Wu 等研究人员在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Usp11 maintained the survival of marginal zone B cells under ionizing radiation by deubiquitinating DLL1 and JAG2” 的论文。该研究对于深入理解电离辐射对免疫系统的影响机制,以及寻找潜在的治疗靶点具有重要意义,为解决放疗中造血和免疫损伤这一临床难题提供了新的思路和方向。
一、研究背景
放疗在临床应用广泛,但辐射会引发诸多副作用,其中造血和免疫系统对电离辐射极为敏感。全身暴露于中高剂量电离辐射可导致骨髓和外周免疫系统急性损伤,引发急性放射病,降低机体抗感染能力,增加出血风险,致使患者死亡率升高,严重影响放疗效果。
脾脏作为重要的造血和免疫器官,含有 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞。B 细胞在脾脏中可分为 B1 细胞和 B2 细胞,B2 细胞又进一步分为滤泡 B 细胞(FO B)和边缘区 B 细胞(MZ B)。MZ B 细胞位于脾脏边缘区,能直接对血源性病原体做出反应,在先天免疫和适应性免疫之间起桥梁作用,对维持机体免疫平衡至关重要。因此,明确 MZ B 细胞发育、分化和维持过程中的关键分子意义重大。
泛素 - 蛋白酶体途径(UPS)在细胞调控机制中占据重要地位,参与 B 细胞的多种生命过程。去泛素化酶(DUBs)作为泛素化的关键调节因子,发挥着不可或缺的作用。Usp11 作为一种泛素羧基末端水解酶,可调节 TGF - β 受体、IAP、γH2AX 和 NF - κB 等蛋白质的稳定性和功能,参与炎症和免疫反应调节。此前研究发现,Usp11 缺失对急性移植物抗宿主病(aGvHD)的发生发展有影响,基于此,研究人员推测脾脏可能在 Usp11 介导的免疫调节中起关键作用,并开展了此项研究。
二、研究材料与方法
(一)实验动物
选用雌性 C57BL/6J(WT)小鼠和 Usp11 基因敲除的 C57BL/6N 小鼠(Usp11-/-),通过 PCR 和 Western blotting 技术对小鼠基因型进行验证。实验过程中,小鼠饲养于苏州大学动物设施的 SPF 环境,随机分组,采用单盲法开展动物实验,并遵循 NIH 指南以及苏州大学机构动物护理和使用委员会批准的方案。
(二)照射小鼠模型构建
选取 6 - 8 周龄的 Usp11-/- 雌性小鼠和野生型雌性小鼠,使用德国西门子 KD - 2 6MV X 射线直线加速器进行全身照射,总照射剂量为 7.5 Gy,剂量率为 200 cGy/min。
(三)辐射损伤临床评分
依据辐射诱导疾病的临床评分系统,从毛发状况、驼背体征、呼吸和运动、食欲、脱水情况、体重变化和体温等多方面进行综合评分。当单一参数达到 6 分或参数 A - G 的综合评分大于等于 15 分,以及出现意识丧失、无法保持直立姿势、呼吸困难和抽搐等情况时,对小鼠实施安乐死。
(四)脾脏切除术
通过无菌眼科剪刀切开小鼠皮肤和腹膜,用眼科镊子找到并结扎脾动脉,随后切除整个脾脏,最后缝合腹膜和皮肤。
(五)其他实验方法
还运用了单细胞测序、单细胞 RNA - seq 数据预处理、组织病理学和免疫组化、免疫荧光、ELISA、流式细胞术、细胞培养和转染、免疫共沉淀以及数据库分析等多种实验技术,并使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析,以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。
三、研究技术路线
首先构建全身照射的急性辐射综合征小鼠模型,对比 Usp11-/- 和 Usp11+/+ 小鼠受辐射后的生理病理变化。利用单细胞测序分析脾脏细胞特征,通过 HE 染色、免疫组化和免疫荧光染色观察脾脏组织学变化。运用流式细胞术检测不同 B 细胞亚群数量,ELISA 测定血清和脾脏中 IgM 和 IgG 水平。给予 Usp11 抑制剂米托蒽醌干预,观察对小鼠脾脏和 MZ B 细胞的影响。通过免疫共沉淀和泛素化实验探究 Usp11 与 Notch 配体 DLL1 和 JAG2 的相互作用机制。
四、研究结果
(一)Usp11 基因敲除减轻辐射诱导的损伤
构建 7.5 Gy 全身照射的急性辐射综合征小鼠模型后发现,Usp11-/- 小鼠在照射后体重恢复更快,生存状态更佳,存活率显著高于野生型小鼠。对骨髓进行组织学检查,发现照射后 Usp11+/+ 和 Usp11-/- 小鼠的骨髓均严重受损,且两组在股骨损伤上无明显差异,表明骨髓变化并非影响生存时间延长的关键因素。进一步研究发现,脾脏切除后,Usp11+/+ 和 Usp11-/- 小鼠在全身照射后的存活率变得相近。由此可见,Usp11 在促进辐射诱导的损伤中发挥作用,脾脏在这一过程中至关重要。此项结论通过建立小鼠模型,对比观察 Usp11 基因敲除和野生型小鼠受辐射后的体重变化、生存状态、存活率以及骨髓和脾脏切除后的情况得出。
(二)Usp11 调节电离辐射诱导的脾脏免疫细胞重塑
对 Usp11+/+ 和 Usp11-/- 小鼠照射前后的脾脏细胞进行单细胞测序,经严格质量控制后,从四个样本中分离出 50,485 个免疫细胞,并分为 28 个独特的簇。UMAP 分析显示,Usp11-/- 小鼠的脾脏免疫细胞在辐射后发生重构,B 细胞数量相较于野生型明显增多。这表明 Usp11 在调节辐射后脾脏免疫细胞组成方面具有重要作用,B 细胞在辐射后的免疫反应调节中扮演关键角色。该结论基于单细胞测序和 UMAP 分析技术,对不同基因型小鼠辐射前后脾脏免疫细胞进行分类和分析得出。
(三)Usp11 调节电离辐射暴露引发的脾脏组织学改变
对小鼠脾脏进行 HE 染色,结果显示两组小鼠脾脏均出现结构模糊、淋巴细胞计数减少、红细胞弥漫渗出和轻度髓外造血等变化。Usp11-/- 小鼠在 TBI 后组织学评分降低,脾脏边缘区显著变窄。通过免疫组化和免疫荧光染色分析发现,巨噬细胞和 T 细胞在两组小鼠脾脏边缘区的数量和分布在照射前后均无明显差异,但 Usp11-/- 小鼠在 TBI 后 6 天和 12 天,脾脏中 B 细胞数量明显多于 Usp11+/+ 小鼠,且 6 天时边缘区 B 细胞显著增加。结合数据库分析,表明 Usp11 在调节 B 淋巴细胞相关生物学过程中可能起关键作用。这些结论通过对脾脏组织进行染色观察,结合免疫组化和免疫荧光染色技术,以及数据库分析得出。
(四)Usp11 维持 TBI 后 MZ B 细胞的存活
对单细胞测序结果中的 B 细胞亚群进行分析,发现 Usp11 在所有 B 细胞亚群中均有表达。照射后,Usp11-/- 小鼠的 B_marginal_zone_Hbb 簇明显富集。通过流式细胞术检测发现,TBI 后 Usp11-/- 小鼠脾脏中的 B 淋巴细胞和 MZ B 细胞数量均多于 Usp11+/+ 小鼠。对脾脏和血清中的 IgM 和 IgG 进行检测,结果显示 Usp11-/- 小鼠在 TBI 后 6 天脾脏中 IgM 抗体产生增加,12 天血清中 IgM 水平升高、IgG 水平降低。这表明 Usp11 能够维持 TBI 后 MZ B 细胞的存活,影响抗体产生。该结论通过单细胞测序分析 B 细胞亚群,结合流式细胞术检测 B 淋巴细胞和 MZ B 细胞数量,以及 ELISA 测定抗体水平得出。
(五)靶向 Usp11 的干预策略调节电离辐射诱导的免疫系统损伤
米托蒽醌作为 Usp11 的抑制剂,给予野生型小鼠米托蒽醌处理后进行 TBI,结果显示米托蒽醌干预使 Usp11+/+ 小鼠脾脏边缘区变窄,减轻了电离辐射后 MZ B 细胞数量的减少。流式细胞术分析表明,米托蒽醌处理后,Usp11+/+ 小鼠受 TBI 后 MZ B 细胞的总百分比显著高于 PBS 处理组,且血清 IgM 水平变化表明米托蒽醌干预减少了抗体类型的转变。这说明靶向 Usp11 的干预策略可有效调节电离辐射诱导的免疫系统损伤。此结论通过给予小鼠米托蒽醌干预,对比观察脾脏形态、MZ B 细胞数量和血清抗体水平变化得出。
(六)Usp11 通过调节 Notch 配体的泛素化维持 MZ B 细胞的存活
通过数据库分析发现,Usp11 在正常全血和脾脏中的表达与 Notch 配体 DLL1 和 JAG2 的表达呈正相关。免疫共沉淀和泛素化实验表明,Usp11 与 DLL1 和 JAG2 存在强烈相互作用,并抑制它们的泛素化。Usp11-/- 小鼠脾脏中 Notch 细胞内结构域(NICD)的表达水平高于 Usp11+/+ 小鼠。这揭示了 Usp11 维持 MZ B 细胞存活的潜在机制是通过调节 Notch 配体的泛素化实现的。该结论基于数据库分析、免疫共沉淀和泛素化实验,以及对 NICD 表达水平的检测得出。
五、研究结论与讨论
本研究表明,Usp11 在调节电离辐射诱导的免疫系统损伤中起着关键作用,主要通过对 Notch 配体 DLL1 和 JAG2 的泛素化调控,促进脾脏免疫细胞重塑,维持 MZ B 细胞的存活。Usp11 基因敲除或使用其抑制剂米托蒽醌,能够减轻辐射诱导的损伤,增加 MZ B 细胞的存活率。这一发现为辐射诱导的免疫损伤机制提供了新的见解,提示 Usp11 可能成为预防和治疗辐射诱导的造血和免疫系统损伤的潜在治疗靶点。
然而,该研究也存在一定的局限性。由于缺乏理想的抗体,无法通过 IP - UB 实验验证 DLL1 和 JAG2 作为 Usp11 的去泛素化底物;未研究 Usp11 过表达或敲低对 DLL1 和 JAG2 蛋白水平的影响;也未进行挽救实验来进一步证实 Usp11 通过 Notch 配体调节 MZ B 细胞存活的机制。未来需要开展更深入的机制研究和大规模的临床试验,以验证 Usp11 作为治疗靶点的临床可行性。尽管如此,该研究为后续探索辐射损伤的治疗策略奠定了重要基础,有望为放疗患者的临床治疗带来新的突破。