鸢尾素在朊病毒病治疗中的关键作用:基于 UCP2 - AMPK 通路的研究新进展
中国农业大学国家兽医公共卫生安全重点实验室、农业农村部动物流行病学重点实验室、国家动物传染性海绵状脑病实验室、动物医学院的裴文、孙志新、杨东明等研究人员,于 2025 年在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Irisin regulates oxidative stress and mitochondrial dysfunction through the UCP2 - AMPK pathway in prion diseases” 的论文。该研究首次揭示了鸢尾素(Irisin)在朊病毒病中的关键保护机制,为这类致命性神经退行性疾病的治疗开辟了新方向,对推动神经科学领域的发展具有重要意义。
一、研究背景
朊病毒病是一类致命的神经退行性疾病,其特征为细胞朊蛋白异常折叠成致病形式。在疾病发展过程中,氧化应激和线粒体功能障碍发挥着重要作用。线粒体作为细胞能量代谢的核心细胞器,极易受到氧化应激的影响,一旦受损,会导致细胞凋亡。其中,解偶联蛋白 2(UCP2)在神经系统中高度表达,参与调节细胞内活性氧(ROS)稳态,与帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病密切相关。同时,AMPKα 在调节氧化应激和线粒体功能方面也至关重要,激活 AMPKα 可刺激 Nrf2,增强抗氧化基因表达,减少 ROS 生成,抑制细胞凋亡。
鸢尾素是一种内源性肌细胞因子,具有抗炎和抗氧化特性,且能穿越血脑屏障在大脑中发挥神经保护作用。然而,其在朊病毒病中对抗氧化应激和线粒体功能障碍的具体作用机制尚不明确。本研究旨在评估鸢尾素在朊病毒病模型中的保护作用,并深入探究其潜在机制。
二、研究材料与方法
(一)细胞培养
选用 N2a 小鼠神经母细胞瘤细胞系和 SH - SY5Y 人神经母细胞瘤细胞系,分别在含 10% 胎牛血清的杜氏改良 Eagle 培养基(DMEM)和 DMEM/F12 培养基中培养,培养条件为 37°C、5% CO?。
(二)实验试剂
实验使用纯度超 98% 的 PrP106 - 126 肽,其序列为 KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG,同时设置乱序序列作为对照。鸢尾素、AMPK 激活剂 AICAR、AMPK 抑制剂 Compound C、蛋白酶体抑制剂 MG132 等试剂均购自相应公司,并按实验要求配置成不同浓度使用。
(三)质粒与转染
实验所用的 UCP2 siRNA、Nrf2 siRNA、pcDNA3.1 (+)-UCP2、pcDNA3.1 (+)-Nrf2 质粒等均从特定公司获取。采用 Lipofectamine 3000 试剂将相关质粒转染至 N2a 细胞中。
(四)实验检测方法
- 细胞活力检测:利用 Cell Counting Kit - 8(CCK - 8)检测不同处理组细胞活力,通过酶标仪在 450nm 波长处测定吸光度。
- 细胞凋亡检测:运用 Annexin V - FITC 和碘化丙啶(PI)染色,结合流式细胞术定量分析细胞凋亡率;同时采用 TUNEL 染色,借助共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。
- 线粒体相关指标检测:使用 JC - 1 试剂盒检测线粒体膜电位;采用 ATP 检测试剂盒测定 ATP 水平;通过 qPCR 分析线粒体 DNA(mtDNA)拷贝数;依据试剂盒说明书检测线粒体呼吸链复合物活性。
- 氧化应激指标检测:测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量以及谷胱甘肽 / 氧化型谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)评估氧化应激水平;利用 MitoSOX 染色和流式细胞术检测线粒体 ROS(mtROS)含量。
- 免疫荧光染色与成像:对细胞进行免疫荧光染色,用共聚焦显微镜获取荧光图像,并通过 ImageJ 软件分析。
- 蛋白质检测:采用 Western blot 技术检测相关蛋白表达水平;使用核质蛋白提取试剂盒分别提取核蛋白和细胞质蛋白,线粒体和胞质蛋白提取试剂盒提取线粒体和胞质蛋白。
- RNA 检测:运用 TRIzol 试剂提取细胞总 RNA,经逆转录生成 cDNA 后,通过实时定量 PCR(qPCR)分析基因表达水平。
(五)技术路线
本研究首先构建 PrP106 - 126 诱导的 N2a 细胞朊病毒病模型,给予不同浓度鸢尾素处理,检测细胞活力和凋亡情况。接着,深入探究鸢尾素对线粒体功能的影响,包括线粒体形态、膜电位、mtDNA 拷贝数、ATP 水平及呼吸链复合物活性等指标。随后,分析鸢尾素对氧化应激相关指标的作用,并通过干扰 UCP2 表达,研究其在鸢尾素保护机制中的作用。进一步探讨鸢尾素是否通过 UCP2 - Nrf2 和 UCP2 - AMPK 通路发挥保护效应,最终明确鸢尾素在朊病毒病中的保护机制。
三、研究结果
(一)鸢尾素减少 PrP106 - 126 诱导的神经元凋亡
CCK - 8 实验表明,150μM PrP106 - 126 处理后 N2a 细胞活力显著下降,100ng/mL 及以上浓度的鸢尾素能有效缓解其毒性作用。Annexin V 结合实验和 TUNEL 染色显示,PrP106 - 126 处理导致细胞凋亡显著增加,而鸢尾素预处理可明显降低凋亡细胞数量。Western blot 分析发现,鸢尾素处理显著抑制 caspase - 3、caspase - 9 激活,降低 Bax/Bcl - 2 比值,减少细胞色素 c 释放。在 SH - SY5Y 细胞中也得到类似结果,表明鸢尾素能有效抑制线粒体依赖的细胞凋亡途径。
(二)鸢尾素减轻 PrP106 - 126 诱导的 N2a 细胞神经元线粒体功能障碍
通过共聚焦显微镜观察发现,PrP106 - 126 处理导致 N2a 细胞线粒体网络破碎,而鸢尾素处理可改善线粒体网络完整性。PrP106 - 126 处理使线粒体膜电位降低、mtDNA 拷贝数减少、ATP 水平下降,鸢尾素预处理则可显著改善这些指标。此外,鸢尾素还能恢复 PrP106 - 126 处理后降低的线粒体呼吸链复合物 I - IV 活性,表明鸢尾素可有效缓解 PrP106 - 126 诱导的线粒体功能障碍。
(三)鸢尾素通过减轻氧化应激缓解 PrP106 - 126 诱导的 N2a 细胞线粒体功能障碍
使用线粒体靶向的超氧化物歧化酶模拟物 Mito - Tempo 处理发现,PrP106 - 126 处理导致 N2a 细胞 mtROS 水平升高,Mito - Tempo 处理可显著降低 mtROS、MDA 水平,提高 GSH/GSSG 比值,增强 CAT 和 T - SOD 活性,有效恢复线粒体网络的结构和功能。同样,鸢尾素处理也能降低 mtROS、MDA 水平,改善 GSH/GSSG 比值,增强抗氧化酶活性,表明鸢尾素可通过减轻氧化应激缓解线粒体功能障碍。
(四)UCP2 介导鸢尾素的有益作用
PrP106 - 126 处理显著降低 N2a 细胞 UCP2 转录和蛋白表达水平,鸢尾素处理则可缓解这种下调,并增强 UCP2 与线粒体的共定位。干扰 UCP2 表达实验表明,UCP2 过表达可减轻 PrP106 - 126 诱导的细胞凋亡,而 UCP2 沉默则消除了鸢尾素的抗凋亡作用,证实 UCP2 在鸢尾素保护作用中至关重要。
(五)鸢尾素通过 UCP2 缓解氧化应激并维持线粒体功能
UCP2 敲低实验显示,敲低 UCP2 后,鸢尾素抑制 mtROS 生成、减轻脂质过氧化和氧化损伤的能力丧失,无法保护线粒体功能,包括线粒体形态、膜电位、ATP 水平、mtDNA 拷贝数及呼吸链复合物活性等指标均无法恢复。相反,UCP2 过表达可改善线粒体结构和功能,进一步证明 UCP2 在鸢尾素抗氧化和保护线粒体功能中的关键作用。
(六)鸢尾素通过 UCP2 - Nrf2 途径减轻 PrP106 - 126 诱导的 N2a 细胞氧化应激
研究发现,PrP106 - 126 处理降低 Nrf2 和 HO - 1 水平,鸢尾素处理则上调其表达。Nrf2 过表达可抵抗 PrP106 - 126 诱导的氧化损伤,而 Nrf2 敲低则消除了鸢尾素对氧化应激指标的抑制作用。在 UCP2 敲低细胞中,鸢尾素无法增加 Nrf2 和 HO - 1 表达,表明 UCP2 是鸢尾素激活 Nrf2 信号通路的关键环节,且 Nrf2 与 UCP2 在鸢尾素抗氧化作用中存在相互调节关系。
(七)UCP2 调节 AMPK 活性影响 Nrf2 - HO - 1 途径
鸢尾素预处理和 UCP2 过表达均可增加 N2a 和 SH - SY5Y 细胞中 AMPK 磷酸化水平,UCP2 沉默则消除了鸢尾素对 AMPK 的激活作用。抑制 AMPK 磷酸化不仅阻断了鸢尾素诱导的 Nrf2 和 HO - 1 表达上调,还抑制了 Nrf2 核转位,降低了鸢尾素抑制 mtROS 水平的能力。使用蛋白酶体抑制剂 MG132 实验表明,鸢尾素可通过抑制 Nrf2 蛋白酶体降解或增强其稳定性来促进 Nrf2 积累,且 AMPK 在这一过程中发挥重要作用,表明 UCP2 和 AMPK 通过激活 Nrf2 - HO - 1 途径在 PrP106 - 126 诱导的氧化应激反应中发挥关键抗氧化保护作用。
四、研究结论与讨论
本研究表明,外源性鸢尾素可通过 UCP2 - AMPK 信号通路减轻 PrP106 - 126 诱导的 N2a 和 SH - SY5Y 细胞凋亡,缓解氧化应激,改善线粒体功能,增强电子传递链活性。这一发现为朊病毒病的治疗提供了新的潜在治疗策略。
鸢尾素作为一种肌细胞因子,能穿越血脑屏障,在神经组织中发挥抗氧化和抗炎作用。在多种神经退行性疾病模型中,外源性鸢尾素已被证明可降低氧化应激水平,增强线粒体功能。本研究中,100ng/mL 的鸢尾素有效缓解了 PrP106 - 126 诱导的氧化应激和线粒体功能障碍,与其他研究结果一致,为鸢尾素在朊病毒病治疗中的应用提供了有力支持。
PrP106 - 126 诱导的神经元凋亡与线粒体功能障碍密切相关。鸢尾素通过改善线粒体膜电位、恢复线粒体形态、增强线粒体呼吸链复合物活性等方式,保护线粒体功能,从而减轻细胞凋亡。同时,研究使用 Mito - Tempo 证明了氧化应激在 PrP106 - 126 诱导的线粒体功能障碍中的关键作用,鸢尾素可通过减轻氧化应激来缓解线粒体损伤。
UCP2 在鸢尾素的保护机制中起核心作用。鸢尾素与 UCP2 相互作用,减少 PrP106 - 126 诱导的氧化应激,UCP2 的干扰会消除鸢尾素的保护作用。此外,UCP2 通过激活 AMPK,调节 Nrf2 转录活性,增强抗氧化酶 HO - 1 表达,进一步减轻细胞内氧化应激。
与其他神经退行性疾病模型不同,在朊病毒病模型中,鸢尾素的神经保护作用不依赖于 AKT 和 ERK1/2 信号通路,而是主要通过 UCP2/AMPK/Nrf2 轴发挥作用。这表明鸢尾素在不同神经退行性疾病中的作用机制存在差异,未来研究应进一步明确其在不同疾病中的具体机制,以开发更具针对性的治疗方法。
综上所述,该研究揭示了鸢尾素在朊病毒病中的重要保护机制,为治疗这类难治性神经退行性疾病提供了新的靶点和潜在治疗药物,具有重要的理论和临床应用价值。但目前研究仍处于细胞实验阶段,后续需进一步开展动物实验和临床试验,验证鸢尾素在体内的治疗效果和安全性,推动其从基础研究走向临床应用。