通过YAP/ taz介导的TRAIL-R2/DR5信号通路调控内质网应激诱导的凋亡和炎症反应

【字体: 时间:2025年02月05日 来源:Cell Death Discovery 6.1

编辑推荐:

  

  

细胞微环境力学信号调控新机制:YAP/TAZ 对肿瘤细胞应激反应的关键作用


西班牙塞维利亚的安达卢西亚分子生物学与再生医学中心(Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa-CABIMER)的研究人员 Y. El Yousfi、F. J. Fernández-Farrán 等人,在《Cell Death Discovery》期刊上发表了题为 “Regulation of ER stress-induced apoptotic and inflammatory responses via YAP/TAZ-mediated control of the TRAIL-R2/DR5 signaling pathway” 的论文。这一研究成果在肿瘤学领域意义重大,为深入理解肿瘤细胞在应激环境下的命运调控机制提供了新视角,有望为肿瘤治疗策略的开发提供理论依据。

一、研究背景


肿瘤细胞所处的微环境与正常组织差异显著,细胞常暴露于内质网(ER)应激等不利条件下。当细胞内未折叠或错误折叠的蛋白质积累时,会激活未折叠蛋白反应(UPR)。适度的 UPR 可帮助细胞恢复内稳态,但当 ER 应激超过一定阈值,就会引发细胞凋亡。

细胞外基质(ECM)作为肿瘤微环境的重要组成部分,其刚度等机械特性对肿瘤细胞的命运有着重要影响。Yes 相关蛋白(YAP)及其同源物具有 PDZ 结合基序的转录共激活因子(TAZ),作为 Hippo 通路的下游转导因子,在肿瘤发展过程中发挥关键作用。已有研究表明,机械转导对 YAP/TAZ 的调控可能参与肿瘤细胞对不同治疗策略的抵抗,但 YAP/TAZ 在介导基质刚度调节的肿瘤细胞对 ER 应激反应中的作用尚不明确。

二、研究材料与方法


(一)细胞培养


研究选用了多种细胞系,包括 HEK293 - T、A549、HeLa 和 HCT116 等。其中,HEK293 - T 细胞由 A. Rodriguez 博士提供,A549 和 HeLa 细胞购自 ATCC,HCT116 细胞由 J.A. Pintor - Toro 博士捐赠。这些细胞分别在 DMEM 培养基(A549、HeLa、HEK293 - T)或 McCoy’s 培养基(HCT116)中培养,培养基添加 10% 胎牛血清、2 mM L - 谷氨酰胺、青霉素(50 U/ml)和链霉素(50μg/ml),A549 细胞培养基还额外添加葡萄糖(4.5 g/l)。所有细胞系均在 37℃、5% CO?、95% 空气的培养箱中培养,并定期检测支原体污染情况。

(二)试剂与抗体


实验中使用的试剂和抗体来源广泛,如 Merck/Sigma - Aldrich、Gibco、Selleckchem 等公司。包括用于细胞培养的各类添加剂、化学试剂,用于检测的碘化丙啶、DAPI 等,以及多种抗体,具体信息在补充材料中列出。

(三)实验技术


  1. 制备聚丙烯酰胺水凝胶:通过不同浓度的丙烯酰胺和双丙烯酰胺混合,制备具有不同刚度的水凝胶,模拟肿瘤微环境中软硬不同的 ECM。水凝胶表面经修饰后与胶原蛋白孵育,用于细胞培养。
  2. 检测细胞凋亡:采用流式细胞术检测细胞凋亡,通过分析亚 G1 期细胞群体或碘化丙啶(PI)摄取情况来定量细胞死亡。
  3. 蛋白质免疫印迹分析:用于检测细胞内蛋白质的表达和修饰情况,以 GAPDH 作为蛋白上样对照,确保实验结果的准确性。
  4. RNA 干扰技术:设计针对 YAP、TAZ、cFLIP 等基因的 siRNAs,转染细胞以沉默相应基因的表达,研究其对细胞功能的影响。
  5. 构建稳定细胞系:利用逆转录病毒和慢病毒载体,将目的基因导入细胞,经抗生素筛选获得稳定表达细胞系,用于后续实验。
  6. 免疫荧光技术:检测细胞内蛋白的定位和表达情况,通过计算 YAP 在细胞核与细胞质的荧光强度比值,评估其核定位情况;利用该技术还可观察 TRAIL - R2/DR5 的聚集情况。
  7. 荧光素酶报告基因检测:采用 8xGTII–lux 荧光素酶报告基因检测 YAP/TAZ - TEAD 的转录活性,以及 NF - κB 荧光素酶报告基因检测 NF - κB 的活性。
  8. 实时定量 PCR:提取细胞 RNA,经逆转录后进行实时定量 PCR,检测相关基因的 mRNA 表达水平。

三、研究结果


(一)基质刚度通过控制 TRAIL - R2/DR5 信号通路调节肿瘤细胞中 ER 应激诱导的细胞死亡


研究人员在模拟软硬不同 ECM 的凝胶底物上培养肿瘤细胞,并使用毒胡萝卜素(thapsigargin)和衣霉素(tunicamycin)诱导 ER 应激。结果发现,在硬 ECM 或塑料上生长的肿瘤细胞对 ER 应激诱导的细胞凋亡更具抗性,而在软 ECM 上生长的 A549 细胞中,caspase - 8 的激活明显增强。进一步通过 RNA 干扰技术敲低 caspase - 8 和 TRAIL - R2/DR5 的表达,发现可显著抑制软 ECM 条件下肿瘤细胞对 ER 应激的敏感性,表明 TRAIL - R2/DR5 介导的凋亡通路在其中发挥重要作用。

(二)YAP/TAZ 转录共激活因子在基质刚度调节 ER 应激诱导的细胞凋亡中的作用


免疫荧光检测显示,在硬水凝胶或塑料上生长的 A549 和 HeLa 细胞中,核 YAP/TAZ 水平显著高于软底物上的细胞。构建表达组成型激活形式 YAP(YAP5SA)的 A549 细胞系,发现其对 ER 应激具有抗性,且与底物刚度无关;诱导表达野生型 YAP(wtYAP)则显著抑制软凝胶上细胞的衣霉素诱导的细胞凋亡。相反,在高刚度塑料底物上生长的 A549 细胞中,通过 siRNA 沉默 YAP/TAZ 表达,可使细胞对毒胡萝卜素更敏感,同时促进 caspase - 8 的激活。而且,YAP/TAZ 沉默对细胞凋亡的促进作用,在敲低 caspase - 8 或 TRAIL - R2/DR5 表达的细胞中受到抑制,表明 YAP/TAZ 通过抑制 TRAIL - R2/DR5 信号通路,调节肿瘤细胞对 ER 应激的反应。

(三)YAP/TAZ - TEAD 信号模块的活性决定肿瘤细胞对 ER 应激诱导的细胞凋亡的抗性


使用 tankyrase 抑制剂 XAV939 处理 A549 细胞,可抑制 YAP/TAZ - TEAD 的活性,显著增强细胞对毒胡萝卜素诱导的 caspase - 8 加工和细胞凋亡的敏感性。构建表达四环素诱导的 GFP 标记的 TEAD 转录因子相互作用抑制剂(TEADi)的 A549 细胞系,添加多西环素诱导 TEADi 表达后,抑制了 TEAD 荧光素酶报告基因的活性,同时使细胞对 ER 应激诱导的细胞凋亡更加敏感。这表明 YAP/TAZ - TEAD 信号模块在调节肿瘤细胞对 ER 应激诱导的细胞凋亡抗性中起重要作用。

(四)YAP/TAZ - TEAD 信号抑制后 TRAIL - R2/DR5 的细胞内聚集和 cFLIP 水平下调


研究发现,在低刚度水凝胶上生长的 A549 细胞中,经毒胡萝卜素处理后,高分子量的 TRAIL - R2/DR5 寡聚体主要出现在细胞内,且 ER 应激会进一步增加其含量。沉默 YAP/TAZ 表达,虽不影响 UPR 的激活和 TRAIL - R2/DR5 的 mRNA 表达,但会显著诱导 TRAIL - R2/DR5 的寡聚化和细胞内聚集,这一现象在 TEADi 细胞中也得到验证。同时,在软 ECM 上生长的细胞或 YAP/TAZ 沉默的细胞中,抗凋亡蛋白 cFLIP 的水平显著降低。敲低 cFLIP 表达可使癌细胞对毒胡萝卜素诱导的细胞凋亡更加敏感,而在 YAP/TAZ 沉默的细胞中过表达 cFLIP,则可抑制 caspase - 8 的激活和细胞凋亡。这说明 YAP/TAZ - TEAD 信号模块通过调节 TRAIL - R2/DR5 的细胞内聚集和 cFLIP 的表达,影响肿瘤细胞对 ER 应激的适应性反应。

(五)YAP/TAZ - TEAD 信号通路参与调节 ER 应激细胞中促炎细胞因子 IL - 8 的表达


在多种肿瘤细胞系中,沉默 YAP/TAZ 表达后,经毒胡萝卜素处理,IL - 8 的 mRNA 表达显著增加,同时 NF - κB 的活性也增强,且 NF - κB 的激活是毒胡萝卜素诱导 IL - 8 上调所必需的。使用 XAV939 抑制 YAP/TAZ - TEAD 信号,或在表达 TEADi 的细胞中诱导其表达,均可增强毒胡萝卜素诱导的 IL - 8 表达。此外,敲低 caspase - 8 或 TRAIL - R2/DR5 的表达,可显著抑制 YAP/TAZ 缺失的 HeLa 细胞中 IL - 8 的表达。这表明 YAP/TAZ - TEAD 信号模块不仅参与抑制细胞凋亡,还在肿瘤细胞 ER 应激时调节 TRAIL - R2/DR5 介导的炎症反应中发挥作用。

四、研究结论与讨论


本研究表明,ECM 刚度通过 YAP/TAZ 调节的机制,控制肿瘤细胞中 ER 应激诱导的 TRAIL - R2/DR5 介导的凋亡信号和炎症反应。YAP/TAZ - TEAD 转录模块在调节肿瘤细胞对 ER 应激的反应中起关键作用,通过抑制 TRAIL - R2/DR5 的细胞内聚集和维持 cFLIP 的表达水平,使肿瘤细胞在 ER 应激条件下保持存活,促进肿瘤的生长和进展。同时,该模块还参与调节 ER 应激诱导的炎症反应,影响肿瘤微环境。

在肿瘤发展过程中,ECM 刚度的改变会激活机械转导信号通路,影响肿瘤细胞的行为。本研究首次揭示了 ECM 刚度通过 YAP/TAZ 共转录激活因子控制 TRAIL - R2/DR5 的寡聚化和细胞对 ER 应激诱导的凋亡敏感性的机制。此外,研究还发现 YAP/TAZ - TEAD 轴在调节肿瘤细胞 ER 应激诱导的促炎反应中具有重要作用。然而,YAP/TAZ 缺失导致 TRAIL - R2/DR5 在细胞内聚集的具体机制仍有待进一步研究。

YAP/TAZ 可能通过调节参与细胞骨架动力学和蛋白质运输的基因转录,影响 TRAIL - R2/DR5 从高尔基体到质膜的运输;也可能作为转录共抑制因子调节 TRAIL 的表达,进而影响 TRAIL - R2/DR5 的聚集。ECM 刚度还通过 YAP/TAZ 调节 cFLIP 的表达,cFLIP 在抑制 TRAIL - R2/DR5 激活的凋亡通路中起重要作用,维持 cFLIP 水平有助于肿瘤细胞在不利环境中存活。

该研究为深入理解肿瘤细胞在 ER 应激条件下的生存机制提供了重要依据,为肿瘤治疗提供了新的潜在靶点。未来的研究可以进一步探讨 YAP/TAZ - TEAD 信号通路与其他细胞内信号通路的相互作用,以及如何针对这一通路开发更有效的肿瘤治疗策略,有望为攻克肿瘤疾病带来新的突破。

相关新闻
生物通微信公众号
微信
新浪微博
  • 搜索
  • 国际
  • 国内
  • 人物
  • 产业
  • 热点
  • 科普
  • 急聘职位
  • 高薪职位

知名企业招聘

热点排行

    今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

    版权所有 生物通

    Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

    联系信箱:

    粤ICP备09063491号