探索 Mettl3 - m6A - NPY 轴对小鼠睡眠调控机制的新进展
浙江大学医学院附属儿童医院的研究人员在《Cell Discovery》期刊上发表了题为 “Mettl3 - m6A - NPY axis governing neuron–microglia interaction regulates sleep amount of mice” 的论文。该研究首次揭示了 Mettl3 - m6A - NPY 轴在调节睡眠行为中的关键作用,为深入理解睡眠调节的分子机制提供了新的视角,也为睡眠障碍的治疗提供了潜在的新靶点,在神经科学领域具有重要意义。
一、研究背景
睡眠是动物和人类健康的重要生理过程,可分为快速眼动(REM)睡眠和非快速眼动(NREM)睡眠。正常的睡眠 - 觉醒转换对维持大脑正常功能至关重要,睡眠不足会导致大脑活动、突触结构和连接改变,进而引发神经功能缺陷。在分子层面,睡眠受多种机制调控,包括遗传学、DNA 和组蛋白修饰等,但 RNA 修饰在调节睡眠行为中的作用此前完全未知。
- 甲基腺苷(
)是最丰富且可逆的 RNA 修饰之一,在神经元系统中,Mettl3 介导的
修饰对神经发生和神经元发育至关重要,并参与神经系统疾病,但它在调节睡眠行为方面的功能尚未明确。
二、研究材料与方法
- 实验动物:使用 C57BL/6 遗传背景的小鼠,通过特定的杂交方式获得兴奋性神经元特异性 Mettl3 条件性敲除小鼠(cKO)和同窝对照小鼠(Ctrl),且实验仅采用雄性小鼠,所有动物实验遵循浙江大学动物护理和伦理委员会批准的方案。
- 监测指标与方法:对小鼠的体重和食物摄入量进行定期监测;通过立体定向注射 AAV 病毒来实现基因的过表达或敲低;运用脑电图(EEG)和肌电图(EMG)记录小鼠的睡眠模式;采用纤维光度法监测 NPY 水平;进行原代星形胶质细胞、原代神经元和 BV2 细胞的分离与培养;运用免疫荧光染色、Sholl 分析、总 RNA 分离和实时 PCR、RNA - seq 分析、GO 分析、Western blot 测定、 dot blot 测定、RIP、 MeRIP - qPCR 等实验技术对相关指标进行检测和分析。
- 关键技术路线:首先构建 cKO 小鼠模型,验证 Mettl3 基因敲除效果,观察其对大脑水平的影响。接着研究 Mettl3 缺失对脑细胞变化、睡眠行为、基因表达的影响,探索其作用机制,包括对 NPY 表达的调控以及与 STAT3 通路的关系。最后通过病毒介导的基因过表达实验,验证外源性 Mettl3 和 NPY 对神经病理学和睡眠行为的影响。
三、研究结果
- Mettl3 缺失降低大脑区域的水平:通过免疫荧光染色、mRNA 和蛋白质水平检测以及 dot blot 测定,发现 cKO 小鼠在 4 个月龄时,丘脑、 retrosplenial 皮质和海马等多个脑区的 Mettl3 强度、mRNA 和蛋白质水平显著降低,水平也明显下降,且 2 个月龄时,Ctrl 和 cKO 小鼠丘脑内小胶质细胞、和星形胶质细胞的百分比无差异,表明 cKO 小鼠神经元细胞中存在 Mettl3 特异性缺失。
- Mettl3 缺失诱导丘脑的神经炎症:对比 4 个月龄的 Ctrl 和 cKO 小鼠,发现 cKO 小鼠丘脑出现显著的神经胶质增生和神经炎症,表现为 Iba1 免疫荧光强度和细胞数量增加,Iba1 和 GFAP 的 mRNA 和蛋白质水平显著升高,小胶质细胞呈现激活状态,且丘脑内炎症细胞因子 TNF - α 和 IL - 1β 的 mRNA 和蛋白质水平显著增加,而在皮质和海马中未观察到这些变化。
- 小胶质细胞激活先于星形胶质细胞:通过免疫荧光染色和 Sholl 分析,发现 cKO 小鼠丘脑内小胶质细胞从 2.25 月龄开始呈现激活状态,而 GFAP 星形胶质细胞在 2.5 月龄时被检测到,3 月龄时显著增加,且从 2.5 月龄到 4 月龄,星形胶质细胞呈现激活状态,表明 Mettl3 缺失诱导的小胶质细胞激活先于星形胶质细胞。
- Mettl3 缺失导致神经元和突触损失:cKO 小鼠丘脑内小胶质细胞数量从 2.25 月龄开始显著增加,4 月龄时进一步增加,而神经元数量在 3 月龄时显著减少,4 月龄时进一步减少,4 月龄时丘脑内突触前标记物 VGluT1 和突触后标记物 PSD95 均显著降低,且在皮质和海马中未发现神经元损失。免疫荧光染色等实验表明,激活的小胶质细胞通过吞噬作用导致神经元损失。
- 神经元 Mettl3 缺失损害睡眠行为:对 2 月龄和 4 月龄的 Ctrl 和 cKO 小鼠进行 EEG 和 EMG 记录,发现 2 月龄时两组小鼠睡眠状态比例和总量无显著差异,4 月龄时 cKO 小鼠清醒状态比例显著增加,NREM 睡眠比例显著减少,REM 睡眠分布无显著差异,且 cKO 小鼠清醒时间显著增加,NREM 睡眠时间显著减少。在成年野生型小鼠丘脑腹后内侧核(VPM)中急性敲低 Mettl3,也得到了类似的睡眠行为改变结果,表明丘脑 Mettl3 确实调节睡眠行为。
- Mettl3 缺失改变丘脑基因表达:对 2 月龄和 4 月龄的 Ctrl 和 cKO 小鼠丘脑组织进行 RNA - seq 分析,发现 2 月龄 cKO 小鼠有 2151 个差异表达基因(DEGs),4 月龄有 2709 个 DEGs。4 月龄 cKO 小鼠中,小胶质细胞和星形胶质细胞相关基因表达增加,神经元相关基因表达减少,激活状态相关基因增加,静止状态相关基因减少。GO 和 KEGG 分析显示,4 月龄 cKO 小鼠上调的 DEGs 富集于神经炎症反应和吞噬作用等,下调的 DEGs 富集于神经肽信号通路、进食行为和节律行为等,表明 Mettl3 缺失改变了与神经炎症和小胶质细胞激活相关的基因表达。
- 神经元 Mettl3 缺失降低 NPY 并激活 STAT3 通路:免疫荧光染色、mRNA 和蛋白质水平检测表明,cKO 小鼠 2 月龄和 4 月龄时丘脑内 NPY 强度、mRNA 和蛋白质水平均显著降低,且 Mettl3 与 NPY mRNA 的结合以及 NPY mRNA 的修饰水平在 cKO 小鼠丘脑中显著下降。RNA - seq 数据分析显示,cKO 小鼠中上调的 DEGs 富集于 JAK - STAT3 通路,且随着小胶质细胞激活、神经炎症和神经元损失的发展,cKO 小鼠丘脑内 pSTAT3/STAT3 比值和总 STAT3 水平逐渐增加,表明 Mettl3 缺失通过下调 NPY 的修饰特异性降低 NPY,并激活丘脑内的 JAK - STAT3 信号通路。
- 异位 NPY 表达改善神经病理和睡眠行为:向成年(2 月龄)Ctrl 和 cKO 小鼠双侧 VPM 注射 AAV 病毒,过表达 Mettl3 和 NPY。结果显示,异位表达 Mettl3 和 NPY 显著减少了 cKO 小鼠丘脑内小胶质细胞和星形胶质细胞的数量,恢复了神经元数量,且显著降低了 cKO 小鼠清醒状态比例,增加了 NREM 睡眠和 REM 睡眠比例,表明外源性 Mettl3 和 NPY 有效恢复了 cKO 小鼠的睡眠行为。此外,通过另一种策略表达异位 NPY 也得到了类似的结果,进一步验证了 NPY 在调节睡眠行为中的关键作用。
四、研究结论与讨论
本研究揭示了 Mettl3 通过调节 NPY 在睡眠行为调节中的关键作用。Mettl3 作为催化
修饰的核心酶,其在 CamkIIα + 兴奋性神经元中的缺失会导致食物摄入和体重、脑重下降,丘脑内小胶质细胞和星形胶质细胞激活、神经元损失。小胶质细胞激活先于星形胶质细胞,激活的小胶质细胞通过吞噬作用导致神经元损失,这些结果表明 Mettl3 在调节神经元与神经胶质细胞之间的相互作用中具有重要功能。
NPY 在多个脑区发挥关键神经调节作用,在丘脑中具有最高的表达和
修饰水平。Mettl3 缺陷特异性降低丘脑内 NPY 水平,神经元 NPY 调节小胶质细胞的稳态,NPY 缺乏会激活其他机制,当这些机制无法维持平衡时,小胶质细胞激活并诱导神经元损失。
睡眠是一个复杂的行为,涉及多个脑区和神经回路。本研究发现丘脑内的 CamkIIα 兴奋性神经元对睡眠至关重要,Mettl3 缺失引发的神经炎症导致神经元损失,影响睡眠。虽然研究显示 VPM 神经元中的 Mettl3 对睡眠有重要影响,但其他丘脑区域神经元对睡眠的作用仍需进一步研究。此外,神经元对 Mettl3 缺失的差异反应机制也有待揭示。
本研究还发现 Mettl3 缺失导致 VPM 神经元中 NPY 表达下降,进而引发睡眠障碍,尤其是 NREM 睡眠障碍。NPY 在睡眠中呈现动态变化,且原发性失眠患者血液中 NPY 水平较低。异位表达 Mettl3 和 NPY 可减少神经炎症和神经元损失,挽救睡眠行为,表明神经元 NPY 是睡眠的重要调节因子,有望成为睡眠障碍患者的治疗靶点。
综上所述,该研究不仅揭示了 Mettl3 - m6A - NPY 轴调节睡眠行为的新机制,还为睡眠障碍的研究和治疗开辟了新的方向,具有重要的理论和临床意义。未来研究可在此基础上,进一步深入探索相关分子机制和潜在治疗策略,为改善睡眠健康提供更多依据。