孕期母体免疫激活影响子代神经干细胞的研究解读
伦敦玛丽女王大学癌症基因组学与计算生物学中心等单位的研究人员 Sandra M. Martín - Guerrero、María Martín - Estebané 等在《Molecular Psychiatry》期刊上发表了题为 “Maternal immune activation imprints translational dysregulation and differential MAP2 phosphorylation in descendant neural stem cells” 的论文。该研究构建了基于神经干细胞的体外模型,深入探究孕期母体免疫激活(MIA)影响子代神经发育的分子机制,对理解神经精神疾病的发病根源具有重要意义,为相关疾病的早期干预和治疗提供了潜在的理论依据。
一、研究背景
孕期的环境应激因素会影响胎儿中枢神经系统的正常发育,进而导致子代出现精神分裂症、自闭症或双相情感障碍等神经精神疾病。在众多环境因素中,孕期母体感染备受关注。既往研究表明,孕期母体感染时产生的促炎细胞因子,而非病原体本身,是导致子代神经发育障碍的关键因素。例如,IL - 6 和 IL - 17A 在这一过程中发挥着重要作用。同时,研究发现孕期母体免疫激活最易诱导子代成年后行为改变的时间窗口为小鼠孕期第 9 天,相当于人类孕期的第一至第二个三月期。虽然此前的临床前研究支持了精神疾病与孕期感染相关的神经发育假说,但 MIA 引发子代神经发育障碍的精确分子变化和机制仍不明确。
二、研究材料与方法
(一)实验动物与药物
实验选用 C57BL/6 J 小鼠,购自 Charles River(西班牙)。Poly (I:C)(聚肌苷酸 - 聚胞苷酸钠盐)购自 Sigma - Merck。所有实验严格遵循欧盟相关动物保护伦理准则,小鼠饲养于温度、湿度适宜且光照周期固定的环境中,自由获取食物和水。
(二)母体免疫激活实验
通过观察精栓和体重增加确定小鼠怀孕,在孕期第 9.5 天对怀孕母鼠进行处理。实验组腹腔注射 Poly (I:C),由于高剂量会导致动物死亡率升高,经测试最终采用 5mg/kg 的剂量;对照组注射等量生理盐水。处理后 2.5h 采集母鼠血液样本检测 IL - 6 水平,孕期第 12.5 天进行剖腹产获取胎儿组织,用于后续神经干细胞的分离培养。
(三)细胞培养
按照既定方法获取小鼠前脑的神经干细胞(NSCs),将其接种于经多聚 - L - 赖氨酸处理的培养板上,在特定的 NSC 扩增培养基中培养和扩增。诱导 NSC 分化时,更换为分化培养基,细胞培养环境为 37°C、5% CO?的湿润环境。
(四)免疫细胞化学
将细胞接种于经多聚 - L - 赖氨酸和层粘连蛋白预处理的盖玻片上,固定后使用特定的一抗和二抗进行免疫标记,并用 Hoechst 33342 对细胞核进行荧光染色,最后利用显微镜采集图像,使用 Image J 软件进行图像处理。
(五)树突形成和轴突形成分析
将 NSC 接种于预处理的 6 孔板,分化 7 天后,通过相差显微镜获取图像,分别利用 Image J 软件中的 Sholl 分析工具评估树突分支复杂性,以及计数树突丝状伪足 / 轴突密度来评估轴突形成情况。
(六)突触发生分析
采用狂犬病病毒单突触追踪方法定量评估体外培养神经元之间的突触形成。构建携带荧光蛋白基因的重组狂犬病病毒,感染表达相应受体的神经元,通过荧光显微镜观察不同荧光信号,使用 FIJI 软件分析不同细胞群体,以特定细胞比例评估突触形成程度。
(七)免疫印迹
对样本进行加热处理后,进行 SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,封闭后与特异性抗体孵育,通过增强化学发光法检测蛋白质抗体相互作用,并用抗肌动蛋白抗体重新印迹评估上样量。
(八)蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析样本制备
对培养细胞进行处理后裂解,超声破碎,离心取上清测定蛋白质浓度。进行磷酸化蛋白质组学分析时,对蛋白质进行还原、烷基化等一系列处理,使用胰蛋白酶消化,再经脱盐、富集磷酸肽等步骤,最后冻干保存;蛋白质组学分析则对蛋白质进行消化、脱盐、干燥保存。
(九)LC - MS/MS 分析
将处理后的肽段重新溶解后进行液相色谱 - 串联质谱分析,通过特定的色谱条件和质谱参数,实现肽段的分离和鉴定。
(十)肽段和蛋白质的鉴定与定量
利用 Mascot Daemon 工作流程和特定数据库对 MS 数据进行分析,实现肽段的鉴定,使用 Pescal 进行无标记定量,通过生物信息学流程处理和分析蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据。
(十一)转录组数据的测序与处理
对 NSC 进行处理后收集细胞,制备 RNA - seq 文库并进行测序。使用特定软件对原始数据进行质量评估、过滤、比对和基因表达分析,通过统计分析确定差异表达基因。
(十二)统计分析
使用 Excel 或 R 软件进行统计分析,采用非配对 T 检验评估差异显著性,利用特定软件进行基因本体分析,使用 ggplot2 软件进行数据可视化。
三、研究技术路线
首先构建孕期 Poly (I:C) 处理的小鼠模型,获取子代胎儿的神经干细胞,分别进行转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。在转录组学分析中,对 NSC 分化前后的样本进行测序和数据分析,确定差异表达基因;蛋白质组学分析则聚焦于 NSC 分化前后及 Poly (I:C) 处理组与对照组间的蛋白质表达差异;磷酸化蛋白质组学分析主要探究分化后两组 NSC 中蛋白质磷酸化水平的差异。同时,对 NSC 的分化能力、神经元的形态和功能进行检测,包括免疫细胞化学鉴定、树突和轴突形成分析以及突触发生分析等,综合各项实验结果揭示 MIA 对 NSC 的影响机制。
四、研究结果
(一)神经干细胞系的生成
从孕期经 Poly (I:C) 或生理盐水处理的孕鼠子代 E12.5 胎儿中获取神经干细胞,成功建立了具有增殖能力的细胞系。通过检测母鼠血清 IL - 6 水平和体温变化,验证了 MIA 模型的有效性。这些细胞系表达多能性标记,在特定条件下可分化为神经元和神经胶质细胞,且两组细胞在分化能力和免疫细胞化学标记方面无显著差异,表明构建的神经干细胞系稳定可靠。
(二)转录组学和蛋白质组学分析
对 Poly (I:C) 和生理盐水处理组的 NSC 进行转录组学和蛋白质组学分析。转录组学数据显示,两组 NSC 分化过程中基因表达变化相似,但分化后的 Poly (I:C) NSC 与生理盐水 NSC 相比,仅 Gasdermin - D 基因显著下调。蛋白质组学分析发现,分化前两组 NSC 蛋白质表达无显著差异,分化后 Poly (I:C) NSC 中有 69 种蛋白质表达水平发生改变,涉及基因表达调控等过程,且与生理盐水组的蛋白质表达变化趋势不同。
(三)分化后 Poly (I:C) 来源的 NSC 的磷酸化差异模式
对分化后的 Poly (I:C) 和生理盐水 NSC 进行磷酸化蛋白质组学分析,发现两组存在不同的磷酸化模式。Poly (I:C) NSC 中有 746 个磷酸肽的磷酸化水平升高,222 个降低。基因本体分析表明,磷酸化水平升高的肽段主要与细胞骨架组织、细胞成分组织和生物发生等相关,且与突触功能相关的细胞成分中磷酸化增加的肽段较多。同时,发现多个参与 GTPases 信号通路的蛋白质磷酸化水平改变。
(四)分化后 Poly (I:C) NSC 中微管相关蛋白(MAPs)的磷酸化改变
MAPs 家族在神经元发育中起关键作用,其功能受磷酸化调节。研究发现,分化后的 Poly (I:C) NSC 中 MAPs 家族多数成员磷酸化状态改变,如 Map1a、Map1b、Map2 和 Map4 的磷酸肽数量增加,而 Tau、Doublecortin 等则大多磷酸化降低。同时,参与调节 MAPs 家族磷酸化的 Mark2 和 Mark3 激酶磷酸化增加,提示 MAPs 家族功能可能受损。
(五)Poly (I:C) NSC 的功能改变
研究发现,虽然不同组 Map2 蛋白质表达水平无显著差异,但免疫印迹显示分化的生理盐水 NSC 中 Map2 免疫反应性缺失,Poly (I:C) NSC 中表达较低。在神经元形态和功能方面,两组神经元树突分支复杂性无差异,但 Poly (I:C) NSC 分化的神经元树突丝状伪足 / 轴突密度增加,突触形成减少,表明蛋白质磷酸化变化影响了神经元功能。
五、研究结论
本研究利用源自胎儿组织的神经干细胞构建的体外模型表明,孕期早期母体免疫激活会在子代干细胞中留下持久的改变。这些改变主要体现在蛋白质翻译失调和 MAP2 的差异磷酸化上,最终导致神经元在突触连接建立方面的成熟缺陷。这一研究结果为理解孕期母体免疫激活影响子代神经发育的机制提供了新的视角,有助于进一步探究神经精神疾病的发病机制,为相关疾病的早期诊断和干预提供理论基础。
六、讨论
(一)研究成果与以往研究的关联
本研究结果表明,Poly (I:C) 处理的 NSC 与生理盐水处理的 NSC 之间的差异主要体现在蛋白质变化上,尤其是细胞分化为神经元和神经胶质细胞后更为明显,而转录组学未检测到显著差异,这暗示了翻译水平可能存在差异。以往对 MIA 的研究多集中在子代转录组学变化上,本研究与之不同,且发现的蛋白质表达差异可能与 mRNA 翻译失调或蛋白质稳态异常有关,这与以往使用 Poly (I:C) 的 MIA 实验结果一致。
在研究 HDAC1 时,本研究结果与以往部分研究存在差异,体现了 HDAC1 调节机制的复杂性。对于 MAP2,本研究中分化的 Poly (I:C) NSC 出现高磷酸化状态,且免疫印迹中生理盐水处理组出现免疫反应性缺失,这与精神分裂症患者大脑样本中的研究结果有相似之处,支持了 MAP2 结构和 / 或翻译后修饰改变可能具有致病作用的假说。
(二)研究的重要意义
本研究首次利用源自 MIA 处理动物胎儿组织的神经干细胞系进行多组学研究,为探究 MIA 影响子代神经发育的机制提供了新模型。研究发现的蛋白质翻译失调和 MAP2 磷酸化差异,有助于解释孕期感染导致子代神经精神疾病的潜在机制,为开发针对这些疾病的早期干预策略提供了潜在的分子靶点。
(三)研究的局限性
本研究采用的实验方法与传统 MIA 研究不同,构建的神经干细胞系模型与体内环境存在差异,因此研究结果外推至体内情况时需谨慎。此外,本研究主要关注神经元的结构和功能变化,对于更广泛的神经发育结局的反映存在局限性,后续需要更多研究来验证和拓展本研究的发现。
本研究在孕期母体免疫激活影响子代神经干细胞的研究方面取得了重要进展,但仍需进一步深入研究以明确相关机制,为神经精神疾病的防治提供更坚实的理论基础。