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脂肪操纵移植可抑制体外和小鼠模型肿瘤的生长和增殖。
工程化脂肪细胞移植抑制癌症进展的研究解读
美国加利福尼亚大学旧金山分校(University of California San Francisco)的研究人员在《Nature Biotechnology》期刊上发表了题为 “Implantation of engineered adipocytes suppresses tumor progression in cancer models” 的论文。该研究开发了一种名为脂肪操纵移植(AMT)的技术,利用工程化脂肪细胞与肿瘤竞争营养,显著抑制癌症进展,为癌症治疗提供了一种极具潜力的新策略,有望为多种癌症的治疗带来突破。
一、研究背景
肿瘤是由癌细胞和非癌细胞在缺氧和营养匮乏的微环境中组成的复杂组织。肿瘤细胞为了在这种环境中生存和增殖,会重新编程代谢途径,对葡萄糖和脂肪酸等营养物质的摄取和代谢能力增强。癌细胞主要通过有氧糖酵解(即 Warburg 效应)代谢葡萄糖,即使在有氧条件下,其葡萄糖摄取和乳酸生成也会增加。在缺氧时,癌细胞还会增加脂质利用。针对癌症的葡萄糖和脂肪酸代谢进行靶向治疗一直是研究热点,已有多种药物用于抑制相关代谢途径,但仍面临诸多挑战。例如,通过冷激活棕色脂肪组织(BAT)可增加脂肪细胞葡萄糖摄取和脂质代谢,抑制肿瘤生长,但让癌症患者长时间处于寒冷环境并不现实。
二、研究材料与方法
(一)细胞与动物模型
研究使用了多种细胞系,包括人白色前脂肪细胞、小鼠 3T3-L1 前脂肪细胞、多种癌细胞系(如乳腺癌细胞 MCF-7、MDA-MB-436,结肠癌细胞 SW-1417,胰腺癌细胞 Panc 10.05、PANC-1,前列腺癌细胞 DU-145)等。动物模型包括免疫缺陷 SCID 小鼠、胰腺癌 KPC 小鼠模型、乳腺癌 MMTV-PyMT 小鼠模型等。
(二)关键技术路线
- CRISPRa 技术诱导脂肪细胞褐变:利用 CRISPRa 技术上调 UCP1、PPARGC1A 或 PRDM16 基因的表达,设计针对这些基因启动子的 gRNA,克隆到基于腺相关病毒(AAV)的表达载体中,与 dCas9-VP64 共转染人白色前脂肪细胞或小鼠 3T3-L1 前脂肪细胞,诱导脂肪细胞褐变。
- 构建共培养与移植模型:将 CRISPRa 修饰的脂肪细胞与癌细胞进行共培养,观察对癌细胞生长和代谢的影响;构建肿瘤异种移植模型,将 CRISPRa 修饰的人脂肪类器官与癌细胞系共同移植到免疫缺陷小鼠体内;在遗传小鼠模型中,将修饰的小鼠脂肪类器官植入胰腺癌和乳腺癌小鼠模型体内,研究对肿瘤发展的抑制作用。
- 检测方法:通过定量 PCR(RT-qPCR)检测基因表达水平;使用 Seahorse 分析仪测量细胞的氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR),评估细胞的代谢能力;进行葡萄糖摄取、脂肪酸摄取等实验,检测细胞对营养物质的摄取情况;通过免疫荧光染色和 RNA 测序等技术,分析肿瘤组织的增殖、代谢、缺氧和血管生成等相关指标。
三、研究结果
(一)CRISPRa 诱导人白色脂肪细胞褐变
研究人员使用 CRISPRa 技术上调 UCP1、PPARGC1A 或 PRDM16 基因表达。设计针对每个基因启动子的 5 个 gRNA,克隆到 AAV 载体后转染人白色前脂肪细胞。结果显示,转染细胞中多个 gRNA 显著提高了目标基因的表达水平。选择效果最佳的 gRNA 包装 AAV9 病毒感染人分化脂肪细胞,发现感染细胞的目标基因表达进一步增加,同时棕色脂肪标记基因(如 TFAM、DIO2、CPT1b 和 NRF1)的 mRNA 水平也升高。Seahorse 实验表明,CRISPRa - AAV 处理的脂肪细胞整体 OCR 水平增加,非偶联呼吸和最大呼吸能力提升,在基础和胰岛素刺激条件下葡萄糖摄取增加,脂肪酸氧化(FAO)能力也增强。这表明 AAV - 介导的 CRISPRa 上调 UCP1、PPARGC1A 或 PRDM16 可诱导人脂肪细胞褐变,使其具有更高的葡萄糖摄取和 FAO 能力。
(二)CRISPRa 修饰的脂肪细胞在体外抑制肿瘤生长
通过 Transwell 共培养系统,将 CRISPRa 处理的脂肪细胞与 5 种癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-436、SW-1417、Panc 10.05 和 DU-145)共培养。结果显示,与对照组相比,共培养的癌细胞数量显著减少,细胞增殖标记基因 MKI67 表达降低,BrdU 掺入实验也证实癌细胞增殖受到抑制。同时,共培养的癌细胞糖酵解和 FAO 相关指标下降,如 ECAR、葡萄糖摄取、关键糖酵解基因(GCK 和 GLUT4)表达以及 FAO 能力均降低。此外,与已知代谢癌症药物对比,CRISPRa - UCP1 - AAV 脂肪细胞对 MCF-7 细胞生长的抑制效果优于 6 - 氨基烟酰胺,略优于依托莫昔芬。这说明 CRISPRa 修饰的脂肪细胞可减少 5 种癌细胞系的糖酵解和 FAO,显著抑制癌细胞生长。
(三)修饰的人脂肪类器官抑制异种移植瘤生长
研究人员建立了人脂肪类器官培养条件,使用永生化人前脂肪细胞,经特定培养和分化形成脂肪类器官,并验证了其表达多种脂肪生成标记。将 CRISPRa - 修饰的人脂肪类器官与 4 种癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-436、Panc 10.05 和 DU-145)共同移植到免疫缺陷 SCID 小鼠体内。结果显示,与对照组相比,共移植修饰脂肪类器官的肿瘤体积显著减小,肿瘤组织中增殖标记基因 MKI67、糖酵解和 FAO 相关基因表达降低,免疫荧光检测发现 Ki67 + 细胞减少,缺氧(CA9 + 区域)和血管生成(CD31 + 区域)水平降低,同时 caspase - 3 + 细胞增多,表明癌细胞凋亡增加。这表明 UCP1 - CRISPRa 修饰的人脂肪类器官可显著降低体内 4 种癌症类型的糖酵解和 FAO,减少缺氧并抑制肿瘤生长。
(四)修饰的脂肪类器官与肿瘤竞争营养
将 UCP1 - CRISPRa 或对照组脂肪类器官植入 SCID 小鼠体内,使用 CLAMS 系统测量发现,植入 UCP1 - CRISPRa 脂肪类器官的小鼠全身氧消耗增加,葡萄糖耐量和胰岛素敏感性增强,胰岛素水平降低。对共移植的脂肪类器官和 MCF-7 肿瘤进行检测,发现 UCP1 - 修饰的脂肪类器官葡萄糖水平较高,而共植入的肿瘤葡萄糖和脂肪酸水平较低。给小鼠喂食不同饮食(标准饲料、高脂饮食或 15% 葡萄糖水)后进行 MCF-7 异种移植实验,结果显示,喂食标准饲料的小鼠中,与 UCP1 - CRISPRa 脂肪类器官共植入的肿瘤体积明显小于对照组;而高脂饮食或 15% 葡萄糖水处理的小鼠,肿瘤生长与对照组无明显差异。RNA 测序分析表明,标准饲料组肿瘤的基因表达变化显著,涉及代谢调节、细胞生长等多个途径。这些实验表明,UCP1 - CRISPRa 修饰的脂肪类器官通过与肿瘤竞争葡萄糖和脂肪酸抑制肿瘤生长,增加营养物质供应可消除这种抑制作用。
(五)AMT 抑制遗传小鼠模型中的癌症发展
在胰腺癌 KPC 小鼠模型和乳腺癌 MMTV-PyMT 小鼠模型中进行实验。设计针对小鼠 Ucp1 基因的 gRNA,转染小鼠 3T3-L1 脂肪细胞并包装 AAV9 病毒感染脂肪类器官。在 KPC 小鼠 4 周龄时植入 Ucp1 - CRISPRa 或对照组脂肪类器官,6 周后发现植入 Ucp1 - CRISPRa 脂肪类器官的小鼠肿瘤更小,胰腺质量和 Ck19 染色减少,增殖标记基因 Mki67 和 FAO 相关基因表达降低,缺氧和血管生成水平下降,胰岛素水平降低。在 MMTV-PyMT 小鼠 4 周龄时,在乳腺附近或背部植入 Ucp1 - CRISPRa 或对照组脂肪类器官,6 周后发现两种植入方式均使肿瘤大小和体积显著减小,肿瘤组织中增殖标记基因和代谢基因表达降低,缺氧和血管生成水平下降,胰岛素水平降低。这表明 CRISPRa 修饰的脂肪类器官对抑制胰腺癌和乳腺癌的发展具有系统性治疗效果。
(六)乳腺癌组织来源的修饰脂肪细胞抑制肿瘤生长
从手术切除的人乳腺组织中获取脂肪细胞,用 UCP1 - CRISPRa AAV9 处理后与乳腺癌类器官共培养。共培养 5 天后,发现与对照组相比,UCP1 - CRISPRa 处理的脂肪细胞共培养的乳腺癌类器官大小和数量显著减少,增殖标记基因 MKI67 表达降低,糖酵解和 FAO 相关基因表达下降。将 UCP1 - CRISPRa 处理的原发性乳腺脂肪细胞与三阴性乳腺癌类器官共同植入 SCID 小鼠体内,3 周后发现共植入的肿瘤明显小于对照组,肿瘤组织中相关基因表达降低。这表明人乳腺组织来源的脂肪细胞经 AAV9 - CRISPRa 上调 UCP1 后,可抑制乳腺癌类器官生长,具有潜在的临床应用价值。
(七)AMT 抑制高乳腺癌风险细胞增殖
将 UCP1 - CRISPRa 乳腺脂肪细胞与来自 BRCA1/BRCA2/RAD51D 突变携带者的乳腺类器官共培养。结果显示,共培养的乳腺类器官明显小于对照组,数量减少,增殖标记基因 MKI67 和 MTOR 表达降低,CK5 和 CK17 表达减少,表明其具有抑制携带遗传癌症易感综合征供体乳腺类器官癌前表型的潜力。这表明 UCP1 - CRISPRa 乳腺脂肪细胞可能预防高癌症风险个体的癌症发展。
(八)诱导型或细胞支架 AMT 抑制癌症进展
开发诱导型 AAV 载体,使 dCas9 - VP64 在四环素处理后表达,从而调控 UCP1 基因表达。将诱导型 UCP1 - CRISPRa 人脂肪类器官植入 MCF-7 异种移植瘤小鼠体内,喂食多西环素 3 周后,发现与对照组相比,共植入的肿瘤明显更小,增殖标记基因 MKI67 和代谢基因表达降低。将 UCP1 - CRISPRa 人脂肪类器官插入聚己内酯(PCL)微井支架并植入肿瘤旁,结果显示,与对照组相比,共植入的肿瘤明显更小,相关基因表达降低。这表明 AMT 可通过诱导型系统或细胞支架递送平台抑制癌症进展,且该平台可根据肿瘤代谢变化进行调整。
(九)基于尿苷的 AMT 抑制胰腺癌
上调人脂肪细胞和脂肪类器官中尿苷磷酸化酶 1(UPP1)基因表达,设计 gRNA 转染脂肪细胞并包装 AAV9 病毒感染细胞。结果显示,UPP1 - CRISPRa 脂肪细胞对尿苷的摄取和利用增加。将 UPP1 - CRISPRa 或对照组脂肪细胞与胰腺癌细胞系 PANC-1 共培养,发现共培养的 PANC-1 细胞数量减少,ATP、NADH 和乳酸水平降低,添加尿苷可消除这种抑制作用。将 UPP1 - CRISPRa 脂肪类器官与 PANC-1 肿瘤共同移植到 SCID 小鼠体内,3 周后发现共植入的肿瘤明显小于对照组,增殖标记基因 MKI67 表达降低,尿苷分解代谢产物减少。这表明 CRISPRa 上调 UPP1 可降低胰腺癌肿瘤微环境中的尿苷水平,抑制肿瘤生长,展示了 AMT 针对不同癌症代谢途径的临床通用性。
四、研究结论与讨论
研究人员开发的 AMT 技术,利用修饰的脂肪细胞靶向癌症代谢途径,在多种癌症模型中显著抑制肿瘤生长,减少肿瘤的糖酵解、脂肪酸代谢和尿苷利用,改善缺氧和血管生成情况。脂肪细胞作为一种独特的体外治疗系统,具有诸多优势,如临床获取和移植技术成熟,可通过 CRISPRa 技术进行基因调控,还能与多种癌症治疗方法联合使用。
该研究也存在一些需要进一步探索的方向。虽然在小鼠模型中未观察到与癌症相关的恶病质,但长期治疗可能导致体重下降,需要通过控制转基因表达或使用可移除的细胞支架来解决这一问题。未来可进一步优化 AMT 技术,上调更多与癌症治疗相关的基因,利用脂肪细胞的内分泌功能分泌治疗性化合物,或与其他癌症治疗手段更好地结合,提高治疗效果。此外,还需深入研究 AMT 在人体中的安全性和有效性,推动其从实验室走向临床应用,为癌症患者带来新的希望。
总的来说,这项研究为癌症治疗提供了一种创新的思路和方法,AMT 技术展现出巨大的潜力,有望成为个性化癌症治疗的重要组成部分,为攻克癌症这一难题提供新的有力武器。