基于结构转换适配体与 DNA 测序技术定量代谢物的研究解读
多伦多大学唐纳利中心(The Donnelly Centre, University of Toronto)的研究人员 June H. Tan 和 Andrew G. Fraser 在《Nature Biotechnology》杂志上发表了名为 “Quantifying metabolites using structure-switching aptamers coupled to DNA sequencing” 的论文。这一研究成果在代谢组学领域意义重大,为代谢物的定量分析提供了创新方法,有望推动疾病诊断、药物研发等多领域的发展。
一、研究背景
代谢物作为关键的生物标志物,能反映人体健康状况。代谢物水平的调节异常会引发如糖尿病、苯丙酮尿症等多种疾病。然而,对代谢物进行定量分析颇具挑战,因其生化特性高度多样,无法像 PCR 扩增核酸那样简单地进行扩增。代谢组学面临的难题是如何快速、高效地对从组织、血浆到单细胞等各类样本中的不同种类代谢物进行定量分析。
此前,诸多实验检测方法,如药物筛选、蛋白质 - 蛋白质相互作用图谱绘制等,已通过调整利用 DNA 测序作为输出方式,显著提升了检测的深度与速度,实现了大规模平行多重检测。受此启发,本研究旨在将 DNA 测序的强大功能引入代谢组学,开发一种新的代谢物定量检测技术。
二、研究材料与方法
(一)实验材料
研究中所用的所有寡核苷酸均由 Integrated DNA Technologies 合成,并溶解于无核酸酶的水中,浓度为 100μM。适配体序列部分改编自前人研究,部分由 Naloomar 公司利用其专有的 DeepSeq 平台筛选获得。实验用到的配体,如 d - 葡萄糖、d - 半乳糖等糖类,哌喹(PQ)、甲氟喹(MQ)等药物,以及皮质醇等,均配置成相应的储备液备用。实验还使用了 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 磁珠、T7 RNA 聚合酶、DFHBI - 1T 等多种试剂。
(二)实验方法
- 配体结合实验:将磁珠洗涤后与特定比例的配体结合寡核苷酸(LBO)和释放寡核苷酸(SRO)孵育,再与不同浓度的配体孵育,通过测量上清液和剩余磁珠中的荧光强度,计算 SRO 的释放百分比,以此评估适配体与配体的结合情况。针对不同的实验对象,如氨基酸、糖类、抗生素等,使用不同的缓冲体系进行实验。
- SRO 读数检测:通过两种方式检测 SRO 水平。一种是利用含 T7 启动子序列的 SRO,其释放后与互补的报告寡核苷酸杂交,转录生成 Baby Spinach RNA,在 DFHBI - 1T 存在下产生荧光,从而实现对 SRO 释放的定量检测;另一种是使用连接 6 - FAM 荧光基团的 SRO,直接测量荧光强度。
- 适配体的多重检测与测序:将识别 ATP、PQ 或 MQ 的 bSSAs 混合,每个 bSSA 带有独特条形码。收集释放的条形码 SRO 和剩余结合的 SRO,经 PCR 扩增添加适配体序列和索引,进行 MiSeq 测序。通过对测序数据的分析,计算每个条形码 SRO 的释放百分比,实现对多种代谢物的同时检测。
- 药物处理与线虫裂解:以秀丽隐杆线虫为实验对象,用热灭活的 OP50 细菌培养线虫,并对其进行药物处理。处理后裂解线虫,获取线虫裂解液用于后续实验。
- 大肠杆菌中 ATP 水平的定量:选取大肠杆菌的亲本菌株(BW25113)和 ΔcyoA 突变株,培养后收集菌体,进行冷甲醇淬灭、冻融循环等处理,获取上清液。分别使用基于荧光素酶的 ATP 检测法和 ATP 传感器检测法测量 ATP 水平。
(三)关键技术路线
研究的核心技术是 smol - seq(small - molecule sequencing),其关键在于结构转换适配体(SSAs)。每个 SSA 由 LBO 和 SRO 组成,LBO 固定在固体基质上,与 SRO 通过短茎碱基配对。当目标配体与 LBO 的配体结合区域结合时,LBO 发生构象变化,形成稳定的茎环结构,从而释放 SRO。每个 SSA 对应特定的目标分子,其释放的 SRO 带有独特的 DNA 条形码,通过对释放的条形码 SRO 进行测序,就能读出复杂混合物中每种代谢物的水平。
三、研究结果
(一)bSSAs 可检测多种目标
研究人员通过改编现有 SSAs、适配体或获取商业 SSAs,测试 bSSAs 对不同目标的检测能力。实验结果表明,在所有测试案例中,配体浓度越高,与目标结合的传感器越多,释放的条形码 SRO 也越多,释放的条形码水平能够反映目标的水平。如 ATP 的 bSSA 能检测 ATP 含量,且释放的条形码数量与 ATP 浓度相关(图 1b),其他多种配体的 bSSA 也呈现类似规律(扩展数据图 1a)。
(二)bSSAs 具有高特异性
bSSA 的高特异性是 smol - seq 技术的关键。研究发现,ATP 的 bSSA 仅对 ATP 有响应,对其他核苷三磷酸(NTPs)无反应(图 1b);葡萄糖的 bSSA 能区分葡萄糖和半乳糖(图 1c);氨苄青霉素的 bSSA 可识别氨苄青霉素,而对结构相似的羧苄青霉素无响应(图 1d)。此外,bSSAs 甚至能区分立体异构体,如葡萄糖、苯丙氨酸和乳酸的立体异构体(扩展数据图 1b)。在复杂环境中,检测抗疟药哌喹(PQ)的 bSSA 能在细胞裂解液、LB 细菌生长培养基等复杂环境中特异性响应 PQ 水平(图 2a);皮质醇的 bSSA 能在酵母提取物中准确检测外源添加的皮质醇,而不受酵母内源性麦角固醇的干扰(图 2b)。
(三)bSSAs 可实现多重检测
为测试 smol - seq 用于深度靶向代谢组学的能力,研究人员在同一实验中对多个 SSAs 进行多重检测。将识别 ATP、PQ 或 MQ 的 bSSAs 混合,每个 bSSA 带有不同条形码,实验结果显示每个 bSSA 能独立工作,通过条形码测序可并行读取多个传感器的信号,表明 bSSAs 能够实现多重检测(图 2d)。
(四)拓展 bSSAs 检测范围
smol - seq 存在的一个关键限制是特定 bSSA 传感器的线性检测范围有限。为解决这一问题,研究人员开发了一种通用方法,通过对 bSSA 茎区进行细微改变,调整初始亲本传感器,生成一系列具有相同目标特异性但动态范围不同的衍生传感器。以检测 PQ 的传感器为例,衍生传感器组合大大扩展了对 PQ 的检测范围(图 2e),同样的方法在检测万古霉素、葡萄糖和皮质醇时也取得了类似效果(扩展数据图 2c)。
四、研究结论
smol - seq 是一种利用 SSAs 检测和定量代谢物,并以 DNA 序列形式读出其水平的方法。该方法将复杂的代谢组学问题转化为简单的 DNA 测序问题,其输出的 DNA 条形码便于与其他基于序列的工作流程整合,如 RNA 测序,使代谢组学能够纳入其他多组学检测。此外,条形码可通过 PCR 扩增,为空间或单细胞代谢组学研究提供了可能,在样本量和目标丰度受限的情况下具有重要应用价值。
五、研究讨论
本研究建立了 smol - seq 技术的概念验证,证明了 bSSAs 在检测多种目标、特异性和多重检测方面的有效性,同时解决了检测范围有限的问题。然而,该技术仍面临一些挑战,例如进一步提高检测的灵敏度和通量,开发更多针对不同代谢物的高特异性 bSSAs。未来的研究方向可通过经典的指数富集配体系统进化技术(SELEX)与数据驱动的人工智能方法相结合,构建大规模的传感器库,充分发挥 DNA 测序在代谢物和药物定量分析中的强大作用。这一技术有望在疾病诊断、药物研发、精准医疗等领域发挥重要作用,为深入理解生物体内代谢过程提供有力工具。