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作者表明,终末分化的结肠Treg细胞是维持结肠健康所必需的,尽管这些细胞是这种细胞因子的主要产生者,但IL-10对于其抑制功能是必不可少的。
肠道免疫新发现:效应调节性 T 细胞的关键作用
来自霍华德?休斯医学研究所、纪念斯隆?凯特琳癌症中心免疫学项目等机构(第一作者单位为霍华德?休斯医学研究所和纪念斯隆?凯特琳癌症中心免疫学项目)的研究人员在《Nature Immunology》期刊上发表了题为 “Terminal differentiation and persistence of effector regulatory T cells essential for preventing intestinal inflammation” 的论文。该研究对理解肠道免疫调节机制具有重要意义,为治疗肠道炎症性疾病提供了新的理论依据和潜在治疗靶点。
一、研究背景
调节性 T 细胞(Treg cells)是一类具有重要抗炎功能的特殊 CD4+ T 细胞亚群,由转录因子 Foxp3 定义。它对预防和控制自身免疫至关重要,其先天性缺陷或实验性耗竭会引发严重致命的全身性自身免疫和炎症性疾病。此外,Treg 细胞在健康组织、炎症过程和癌症中还具有多种适应性和非适应性功能。
Treg 细胞可分别在胸腺和外周由胸腺细胞和幼稚 CD4+ T 细胞产生,这一过程已被充分研究。然而,成熟 Treg 细胞在次级淋巴器官和非淋巴组织中的激活和分化,以及由此导致的 Treg 细胞状态和功能的多样化,直到最近才开始被探索。外周的 Treg 细胞可分为 “静止” 和 “激活” 或 “效应” 表型,后者具有更强的抑制活性,优先迁移到非淋巴组织,并在炎症条件下扩增。
目前,对于成熟 Treg 细胞在周围环境中是否真的分化为多种效应状态,还是仅采用由环境条件决定的不同瞬时基因表达程序,仍不明确。并且,许多关于 “效应” 和 “静止” Treg 细胞的比较研究存在局限性,常将次级淋巴器官中的 Treg 细胞与非淋巴器官中的进行对比,可能会将细胞的静止状态与低分化状态混淆。因此,研究人员希望在非淋巴组织中专门研究 Treg 细胞的分化,并通过验证的功能分子来识别 Treg 细胞的效应状态。
二、研究材料和方法
(一)实验动物
研究中使用了多种基因工程小鼠,包括
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等,这些小鼠均在特定条件下饲养和繁殖。通过将不同基因的小鼠进行杂交,构建出用于特定研究目的的小鼠模型,如
小鼠等。
(二)实验处理
对小鼠进行多种处理,包括给予 tamoxifen 诱导基因重组,用于细胞命运追踪;使用 bleomycin 诱导肺部慢性炎症;给予抗生素耗竭肠道菌群;利用 dextran sulfate sodium(DSS)诱导结肠炎;通过注射 diphtheria toxin(DT)特异性耗竭 IL - 10 表达的 Treg 细胞等。
(三)细胞分析技术
细胞分离与分选 :对不同组织的细胞进行分离,如通过机械和酶消化的方法从结肠、肺、皮肤等组织获取单细胞悬液,并根据细胞表面标志物使用流式细胞术进行细胞分选,用于后续的测序分析等。
测序技术 :运用 RNA 测序(RNA - seq)、单细胞 RNA 测序(scRNA - seq)、转座酶可及染色质测序(ATAC - seq)等技术,对不同状态的 Treg 细胞进行转录组和表观基因组分析,以探究基因表达和调控机制。
流式细胞术 :用于分析细胞表面标志物和细胞内细胞因子的表达,通过对细胞进行染色和检测,确定不同细胞亚群的比例和特征。
(四)关键技术路线
研究人员首先构建了可识别和标记效应 Treg 细胞的小鼠模型,通过 IL - 10 报告基因小鼠与其他基因小鼠杂交,利用 tamoxifen 诱导的 Cre 重组酶标记 IL - 10 表达细胞,进行细胞命运追踪。然后,对不同状态的 Treg 细胞进行 RNA - seq 和 ATAC - seq 分析,结合生物信息学方法,确定差异表达基因、转录因子结合位点和信号通路。此外,通过构建特定基因敲除或过表达小鼠模型,以及在体外对 Treg 细胞进行转导实验,验证关键基因和转录因子的功能。
三、研究结果
(一)稳定效应 Treg 细胞群体的鉴定
研究人员构建了
小鼠,通过与
小鼠杂交,并引入
重组报告基因,构建出
小鼠用于命运映射。研究发现,结肠中的 IL - 10+ Treg 细胞能稳定维持 IL - 10 表达,与其他组织和结肠引流肠系膜淋巴结中的细胞不同,即使在肠道菌群耗竭、肺部炎症或结肠炎等扰动情况下,仍能保持 IL - 10 表达的稳定性,表明其可能代表一种终末分化的细胞状态。这一结论是通过对不同时间点的小鼠组织进行流式细胞术分析,检测 YFP 和 tdTomato 表达得出的。
(二)结肠 IL - 10+ Treg 细胞表现出终末分化特征
转录组分析 :对 、 和 Treg 细胞进行 RNA - seq 分析,发现它们具有不同的转录特征,参与不同的调节和生理过程。 细胞主要存在于特定的单细胞 RNA 测序(scRNA - seq)细胞簇中,与 细胞相比, 细胞似乎会进一步分化为 细胞,且这一过程与增殖相关。这是通过对 RNA - seq 数据进行 k - means 聚类分析,以及将 bulk RNA - seq 基因簇映射到 scRNA - seq 细胞簇,并使用 Palantir 算法分析细胞分化潜能得出的。
转录因子调控 :通过 ATAC - seq 分析,研究人员发现 TCR 信号下游的转录因子(如 AP - 1 家族成员、Batf、Nr4a2/3)的基序在 细胞中与染色质可及性的丧失相关,表明降低的 TCR 信号与 Treg 细胞向 状态的终末分化有关。同时,Maf、RORγt 等转录因子在诱导 IL - 10 表达中起作用,但在维持 细胞的 IL - 10 表达和细胞状态方面并非必需。这一结论是通过对 ATAC - seq 数据进行分析,构建线性岭回归模型,以及对关键转录因子进行功能验证实验得出的。
(三)长寿命 细胞对 TCR 的依赖性降低
研究发现,
细胞中 TCR 诱导基因的表达总体下降,而 TCR 抑制基因的表达上升,且 TCR 信号通路的负调节因子在
细胞中高表达,表明 TCR 信号在
细胞中有所减弱。通过诱导性敲除 IL - 10 + 细胞中的 TCR,发现部分
细胞相关分子的表达在 TCR 缺失后未改变甚至增加,而一些基因的表达则依赖于 TCR。此外,RNA - seq 分析表明,TCR 缺失促进了
细胞的终末分化相关基因表达。这些结果通过对不同 Treg 细胞亚群的 RNA - seq 分析、TCR 敲除小鼠模型的构建和分析得出。
(四)结肠 Treg 细胞促进组织健康
IL - 10 的作用 :通过构建 小鼠,诱导性敲除 Treg 细胞中的 IL - 10 表达,发现成年小鼠未出现结肠炎症状,表明持续产生 IL - 10 对于预防成年小鼠结肠炎症并非必需。这一结论是通过对敲除 IL - 10 表达的小鼠进行体重监测、结肠长度测量和组织学分析得出的。
IL - 10+ Treg 细胞的功能 :构建 小鼠,特异性耗竭 IL - 10 表达的 Treg 细胞,导致小鼠出现结肠缩短、体重下降、炎症细胞浸润和炎症趋化因子增加等炎症症状,表明 IL - 10+ Treg 细胞对维持结肠健康至关重要,其功能不限于 IL - 10 的产生。此外,在诱导性结肠损伤和炎症模型中,耗竭 IL - 10+ Treg 细胞会加重体重下降,进一步证明其在炎症环境中的重要作用。这些结果通过对特异性耗竭 IL - 10 表达 Treg 细胞的小鼠进行多种指标检测得出。
(五)肠道 IL - 10 表达 Treg 细胞的异质性
研究发现,小肠中的 IL - 10+ Treg 细胞也具有稳定表达 IL - 10 的特征,且与结肠中的
Treg 细胞有一定的相似性,如高表达效应分子 CD39 和 CTLA - 4,低表达 CD62L。但小肠 IL - 10+ Treg 细胞在转录因子表达上存在差异,表达 RORγt 或 Gata3,而结肠中主要为 RORγt+。通过对小肠和结肠 Treg 细胞进行 scRNA - seq 和 TCR - seq 分析,发现 Gata3+IL10 + 和 Rorc+IL10+ Treg 细胞转录上存在差异,且起源于不同的前体细胞池。这一结论是通过对小肠和结肠 Treg 细胞进行单细胞测序和 TCR 测序分析得出的。
四、研究结论与讨论
研究人员通过基因细胞追踪和靶向技术,证明了稳定表达免疫调节细胞因子 IL - 10 可定义结肠中终末分化的效应 Treg 细胞,这些细胞对维持结肠健康至关重要。IL - 10+ Treg 细胞在结肠中似乎经过增殖性扩张后获得这种命运,且其终末分化与 TCR 信号减弱、Maf 和 RORγt 转录因子活性有关。与其他 T 细胞研究中认为终末分化细胞功能失调或耗竭的观点不同,该研究表明终末分化的 Treg 细胞在控制炎症过程和维持结肠健康方面具有重要作用。
此外,研究还发现小肠和结肠环境能够支持
Treg 细胞的产生,而其他组织则不能。虽然研究未明确持续的 TCR 刺激是否为
状态所必需,以及 TCR 信号减弱是否为
状态所必需,但分析结果更支持后者。并且,研究表明组织支持功能并不局限于特定的 Treg 细胞群体,也不是仅由 Batf 控制。
该研究为深入理解肠道免疫调节机制提供了重要依据,揭示了终末分化的 IL - 10+ Treg 细胞在维持结肠健康中的关键作用,为开发针对肠道炎症性疾病的治疗策略提供了新的潜在靶点。未来研究可进一步探索这些细胞发挥功能的具体机制,以及如何通过调节这些细胞来预防和治疗相关疾病。