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这篇综述聚焦淀粉样纤维形成机制，从过饱和及溶解度受限的蛋白质相变角度展开探讨，分析了机械应力、添加剂等对淀粉样纤维形成的影响，还介绍了体外加速淀粉样纤维形成的设备，为相关疾病研究提供了重要参考。
淀粉样纤维形成的一般机制
淀粉样纤维是变性蛋白质形成的纤维状、有序聚集体，与阿尔茨海默病、帕金森病和透析相关淀粉样变性等疾病有关。目前已知有 40 多种人类淀粉样蛋白。这些疾病是由淀粉样纤维或寡聚体在大脑和身体各处沉积引起的。淀粉样纤维形成前有一段延迟期，在此期间会形成淀粉样核或寡聚体，寡聚体可能直接参与细胞毒性。体内形成淀粉样沉积物通常需要数年至数十年，因此人们开发了多种体外方法来加速淀粉样纤维形成。
淀粉样纤维的形成机制与溶质结晶本质相同，由溶解度和过饱和状态决定。以醋酸钠结晶为例，在亚稳过饱和区域，醋酸钠浓度略高于临界浓度（即溶解度），由于成核的高能垒，过饱和状态得以维持。搅拌溶液会破坏过饱和状态，引发从可溶到固态的相变，并伴随热量释放。体内的各种结石病，如尿石症、胆石症和肾结石，也是由小化合物结晶引起的，其基本机制与醋酸钠结晶相同。同样，过饱和的淀粉样蛋白会成核并形成淀粉样纤维，体内机械应力可能通过分子碰撞或蛋白质变性破坏过饱和状态，形成少量核，进而降低自由能垒。
可以用 “未折叠” 蛋白质的构象相图来解释淀粉样纤维的形成，该相图取决于沉淀剂和蛋白质浓度 。过饱和比（σ）或过饱和度（S）是量化相图的重要参数，计算公式分别为σ=[C]/[C]C和S=([C]?[C]C)/[C]C ，其中[C]和[C]C分别是初始溶质浓度和热力学溶解度。在溶解度极限时，σ 和 S 分别为 1 和 0。从亚稳状态到不稳定状态，随着沉淀驱动力（即沉淀剂或蛋白质浓度增加）的增加，这些值会增大。在无定形区域，由于无延迟时间的无定形聚集，难以评估 σ 或 S 值。
在低蛋白质或沉淀剂浓度下，蛋白质处于饱和状态以下（0<σ<1），以单体形式存在于溶液中；在临界浓度（σ=1）时，蛋白质浓度等于溶解度；在亚稳状态（1≤σ），蛋白质浓度略高于溶解度，若无种子，淀粉样纤维无法形成；在不稳定状态（1?σ），蛋白质浓度远高于溶解度，淀粉样纤维会在一定延迟时间后自发形成；当浓度进一步增加，蛋白质容易形成无定形聚集体。机械应力会降低过饱和状态的自由能垒，促进淀粉样纤维形成，在相图中，机械应力会使亚稳和不稳定状态的相界移动，即使在亚稳状态也能诱导淀粉样纤维形成。
溶剂条件可分为两种类型来加速淀粉样纤维形成。一种是大分子拥挤效应，通过减少水可及体积和增加表观溶质（即蛋白质）浓度来增加 σ；另一种是溶剂化效应，通过降低溶解度来增加过饱和度。过饱和状态的稳定性由成核时间（tnuc）表示，它与过饱和比（σ）的关系为logtnuc=α+β(logσ)?2 ，其中 α 是无量纲经验常数，β 由取决于溶质性质和绝对温度的几个变量组成。
到目前为止，虽然对过饱和状态的物理化学机制进行了广泛研究，但仍不清楚其发展、维持和破坏的机制，以及过饱和在淀粉样蛋白成核中的作用，进一步的物理化学研究对理解淀粉样纤维形成机制至关重要。
淀粉样纤维形成加速条件的分类
溶剂化对淀粉样纤维形成的影响
研究发现，盐、醇、洗涤剂、脂质和其他生物聚合物等对蛋白质聚集或稳定有影响。这些溶剂化效应包括：在酸性条件下，中等浓度盐中主要观察到的反离子结合机制；在高盐条件下，与 pH 无关的盐析机制；在中等浓度的洗涤剂（如 SDS）、膜表面或醇中观察到的疏水添加剂结合机制；在低盐条件下的等电点沉淀，此时蛋白质通过疏水相互作用形成紧密构象。这些效应在添加剂的浓度范围和有效性顺序上有所不同。
在霍夫迈斯特系列中，促溶离子（如硫酸根和磷酸根阴离子）对盐析和蛋白质稳定的作用比促变性离子（如硫氰酸根和高氯酸根阴离子）更强，促溶离子能使水结构化，而促变性离子在高浓度盐下会破坏水结构。比较电选择性系列（I?>Br?>Cl?>F? ）和霍夫迈斯特系列（F?>Cl?>Br?>I? ）中单价卤离子的顺序，它们对蛋白质聚集的有效性相反。值得注意的是，在两个系列中，二价的SO42?和磷酸根的有效性都大于单价阴离子。这是因为半径较小的促溶阴离子（如F? ）比半径较大的促变性阴离子（如I? ）水合更多的水分子，增加了表观半径，削弱了与蛋白质的直接静电相互作用。然而，促溶阴离子的盐析效应更强，因为它们比促变性阴离子吸收更多水分子，降低了自由水分子的浓度，从而增加了蛋白质的净浓度。
Raman 等人研究了盐对β2 - 微球蛋白（β2m ）在 pH 2.5 时淀粉样纤维形成的影响，发现较低浓度的盐通过电选择性系列的反离子结合机制加速淀粉样纤维形成。Munishkina 等人在中性 pH 下用不同种类的盐研究了 α - 突触核蛋白（αSyn）的淀粉样纤维形成，发现低浓度盐时通过阴离子结合机制，高浓度盐时通过霍夫迈斯特系列的盐析效应，尽管在某些情况下阳离子的作用可能会改变。
αSyn 是一种由 140 个氨基酸残基组成的内在无序蛋白质，是包括帕金森病、多系统萎缩和路易体痴呆在内的突触核蛋白病的致病蛋白。为了了解 αSyn 淀粉样纤维形成的机制，人们进一步研究了各种添加剂（包括盐和多磷酸盐（polyP））的影响 。polyP 是一种由高能磷酸键连接的无机磷酸盐组成的阴离子生物聚合物，存在于各种微生物和人体细胞中。有趣的是，polyP 依赖的 αSyn 淀粉样纤维形成有两个最佳浓度。较低浓度时，可能是由于带负电的 polyP 与 αSyn 的正电荷之间的反离子结合；较高浓度时，可能是由于霍夫迈斯特盐析效应中磷酸基团的优先水合作用 。这种双模式浓度依赖效应在淀粉样蛋白（amylin）、β2m和溶菌酶的淀粉样纤维形成中也有观察到。蛋白质与盐的相互作用在分子内起作用时，会诱导构象变化为更紧密的结构或稳定天然状态，因此，没有过饱和状态的蛋白质折叠与过饱和状态破坏后才发生的淀粉样纤维形成相互竞争，只有在过饱和状态被破坏后才会形成淀粉样纤维。
大分子拥挤对淀粉样纤维形成的影响
细胞内的大分子拥挤是理解蛋白质稳态背景下淀粉样纤维形成的重要因素。分子拥挤剂对淀粉样纤维形成的影响可通过以下机制解释：排阻体积效应，增加淀粉样蛋白的有效浓度，从而加速淀粉样纤维形成；与拥挤剂（如血清白蛋白）相互作用，减缓淀粉样纤维形成；扩散系数降低，减缓淀粉样纤维形成。霍夫迈斯特盐引起的盐析效应也有排阻体积效应，因为水合离子分子会减少可用溶剂体积。
与大分子拥挤相关的另一个重要话题是液 - 液相分离（LLPS）以及在无序蛋白质中越来越多地观察到的由此产生的生物分子凝聚物或液滴。有些情况下，淀粉样纤维形成之前会发生 LLPS 。例如，FUS 蛋白的低复杂性结构域在淀粉样纤维形成之前会形成相分离液滴。重要的是，当蛋白质定位在液滴界面时，生物分子凝聚物会显著加速淀粉样纤维形成。此外，在两种大分子拥挤剂聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（DEX）存在的情况下，淀粉样纤维形成会加速。在这些条件下，DEX 和 PEG 系统在微相分离状态下的耗尽效应会导致蛋白质（如 αSyn 和A1?40 ）在溶质 PEG 和 DEX 液滴之间的界面处凝聚，从而加速无序蛋白质的淀粉样纤维形成。当大分子排除体积时，系统的熵会增加，因为大分子相互靠近，增加了小分子的空间。这种热力学效应通过耗尽效应在大分子之间产生吸引力，耗尽效应源于排阻体积效应。相反，折叠蛋白质（如 HEWL 和 β2m）在界面处的凝聚会稳定天然状态。考虑这些耗尽相互作用将进一步推进对淀粉样纤维形成机制的理解。
机械应力加速淀粉样纤维形成
搅拌、流体流动和超声等各种机械应力也能通过破坏过饱和状态加速淀粉样纤维形成。实验室常用的搅拌器可增加溶液中单体的表观平均自由程，搅拌时增加的碰撞频率和空气 - 液体界面处的蛋白质浓度，通常会加速蛋白质聚集。此外，旋转珠子也会根据珠子表面的疏水性和其他特性加速淀粉样纤维形成。有报道称，向样品溶液中加入不锈钢丝可加速朊蛋白（PrP）的淀粉样纤维形成 。最近，二氧化硅纳米颗粒（约 50nm）部分由于电吸引增加了底物的局部浓度，增强了 PrP 的淀粉样蛋白成核 。因此，搅拌溶液增加了碰撞频率、空气 - 液体界面以及与珠子表面的相互作用，由于表面变性和变性蛋白质之间的疏水相互作用，有效地加速了淀粉样纤维形成。
在体内，脑脊液（CSF）和血管流动在微观尺度上是湍急的。通过狭窄通道的流动据报道可通过剪切力和拉伸流力加速Aβ和其他蛋白质聚集。微流体技术通过阐明凝聚物的热力学、动力学和其他特性（如扩散系数和相变的饱和浓度），有助于 LLPS 研究。在某些表面存在的情况下，这些蛋白质溶液即使在较低的剪切速率下也会聚集，表明流动和表面的结合可能对淀粉样纤维形成至关重要。最近发现，市售蠕动泵可在液体中产生较大的剪切应力（>200Pa ），引发过饱和状态的有效破坏。
超声是促进淀粉样纤维形成最有效的方法之一。超声波负压产生的空化气泡迅速生长和崩溃，在气泡内产生超过10,000K的极高温区域。超声空化气泡充当成核的催化剂。为了解释明显的频率和压力依赖性成核现象，有人提出了一个理论模型，即单体在气泡生长过程中被困在气泡表面，并在气泡崩溃时高度凝聚。因此，疏水的空气 - 液体界面是淀粉样纤维形成的支架，局部凝聚和加热在促进淀粉样蛋白成核中起主要作用。
虽然超声和搅拌都可有效诱导淀粉样纤维形成和传播，但超声能有效地将淀粉样纤维破碎成短分散纤维，并能以10fM的检测限识别种子 。超声通过超声空化显著改变了聚集反应的能量景观。搅拌时，亚稳区域比静止时更窄，表明搅拌使亚稳 / 不稳定边界向下移动，而不稳定 / 无定形边界几乎不受影响。超声不仅使亚稳 / 不稳定边界向下移动，还使不稳定 / 无定形边界向上移动。施加物理应力（如机械力和剪切力）和空气 - 液体界面可促进淀粉样纤维形成，这些被认为是各种蛋白质聚集障碍的风险因素，因为它们会破坏过饱和状态。
体外扩增淀粉样纤维和加速淀粉样蛋白成核的设备开发
为了有效扩增淀粉样纤维，2001 年开发了一种基于超声的淀粉样纤维扩增方法 —— 蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA），用于朊病毒疾病的早期诊断。在超声作用下，淀粉样纤维被破碎成小片段，然后以单体为底物，在种子的存在下进行扩增。通过重复这个反应循环，可以扩增和检测朊蛋白（PrPSc ）的异常构象。此外，PMCA 还用于扩增帕金森病患者脑脊液中的淀粉样纤维和阿尔茨海默病患者脑脊液中的寡聚体。
Atarashi 等人开发了一种基于搅拌的实时震动诱导转化（RT - QuIC）方法 。通过搅拌溶液，可以检测克雅氏病患者脑脊液中少量的PrPSc 。RT - QuIC 方法改善了朊病毒疾病以及突触核蛋白病和 tau 蛋白病的诊断 。基于搅拌的 αSyn - PMCA 检测（也称为 αSyn - RT - QuIC）可以区分帕金森病和多系统萎缩患者的脑脊液样本。通过结合免疫沉淀和 RT - QuIC 方法（IP/RT - QuIC），可以在突触核蛋白病患者的血清中检测到致病性 α - 突触核蛋白种子。最近，微流体震动诱导转化（Micro - QuIC）这一声学流体平台能够快速、灵敏地检测慢性消耗性疾病。因此，PMCA 和 RT - QuIC 方法及其应用本质上都是以种子为模板扩增淀粉样纤维。另一方面，HANdai 淀粉样爆发诱导剂（HANABI）方法不仅能依赖种子扩增淀粉样纤维形成，还能通过加速成核促进自发淀粉样纤维形成。
HANABI 仪器是由水浴式超声仪和酶标仪组合开发而成。为了评估 HANABI 系统的性能，在 96 孔板中对β2m的淀粉样纤维形成进行了研究，超声 1 分钟和静止 9 分钟为一个循环。在不移动板的情况下，延迟时间的平均值 ± 标准差和变异系数（CV）分别为6.0±4.0h和67%；在移动板的情况下，淀粉样蛋白成核同步，平均值 ± 标准差和 CV 分别为2.0±0.4h和20% 。在一项临床试验中，HANABI 系统用于扩增和检测脑脊液中的种子活性 αSyn，并研究了种子活性与临床指标之间的相关性 。帕金森病患者脑脊液的种子活性高于对照组患者。
此外，HANABI 系统还用于加速鸡卵清溶菌酶溶液的结晶。此前已证明超声可用于加速蛋白质结晶 。使用 HANABI 进行广泛的重复脉冲超声处理，通过破坏过饱和状态产生了许多小而均匀的晶体。然而，由于水浴中温度和溶解气体分布的变化，原始 HANABI 系统的声场可能不一致。为了提高淀粉样纤维检测的重现性和可控性，构建了具有优化超声反应器的 HANABI - 2000 系统，去除了水浴，并在 96 半孔板的每个样品孔中安装了一个共振频率为 30kHz 的单杆状超声换能器 。通过控制施加到每个换能器的驱动信号的电压和频率，使 36 个溶液中的β2m淀粉样纤维形成同步。延迟时间的平均值 ± 标准差和 CV 分别为5.47±1.19h和21.8% 。
使用 HANABI - 2000 的临床试验
HANABI - 2000 用于从蛋白质稳态和分子拥挤的角度阐明透析相关淀粉样变性（DRA）的发病机制。DRA 的病理特征是长期血液透析后，β2m淀粉样纤维在腕管的肌腱周围和滑膜中沉积 。虽然已报道了三种与淀粉样变性相关的β2m突变体：非透析患者中的 D76N 和 P32L，以及 DRA 患者中的 V27M，但 DRA 是由野生型β2m引起的，这表明高浓度的血清β2m和长期透析（即透析时间长）是 DRA 的主要风险因素 。然而，有这些风险因素的患者并不总是发展为 DRA，这表明存在其他风险因素。
首先，为了研究透析时间的影响，比较了接受不同时间血液透析治疗的患者血清与未接受血液透析治疗的血清。这两种血清都抑制淀粉样纤维形成，但两组之间的抑制程度有显著差异，表明透析患者发生淀粉样纤维形成的风险更高。随后，研究了每周三次维持性透析的影响。维持性透析恢复了血清的抑制作用，表明长期透析会恶化血清的抑制作用，而维持性透析则改善了这种抑制作用。重要的是，除β2m外，血清成分的浓度在维持性透析后会暂时增加，这是由于水分排出（通常为体重的 5%），而β2m在血清中的含量会减少 50% 以上。
HANABI - 2000 监测的血清成分与淀粉样蛋白生成潜力之间的关系表明，血清白蛋白在抑制β2m淀粉样纤维形成中起作用。以血清白蛋白为重点的β2m淀粉样纤维形成模型表明，淀粉样纤维形成通过与生物
