华西医院构建新模型来探究膝骨关节炎的发病机制

　　

四川大学华西医院沈彬和解慧琪领导的研究团队在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上发表了题为 “Single-cell transcriptomics reveals novel chondrocyte and osteoblast subtypes and their role in knee osteoarthritis pathogenesis” 的论文。

这项研究通过构建绝经后双足膝骨关节炎（KOA）小鼠模型，结合单细胞转录组学分析，揭示了软骨细胞和成骨细胞的新亚型及其在 KOA 发病机制中的作用，为 KOA 的治疗提供了潜在的治疗靶点和干预途径，对深入了解 KOA 的发病机制和开发新的治疗策略具有重要意义。

研究背景

膝骨关节炎（KOA）是影响中老年人生活质量的主要疾病之一，且发病年龄逐渐年轻化，给全球公共卫生带来了沉重负担。目前尚无有效药物能完全缓解 KOA 的进展，其发病机制复杂，是一种影响整个关节的多因素疾病，其中软骨下骨重塑在 KOA 发展中起关键作用。破骨细胞激活导致软骨下骨早期骨转换增强和小梁恶化，后期骨代谢增加但矿化不足，使得膝关节承受机械负荷增加时，软骨与软骨下骨交界处易发生微骨折，进而破坏潮标，促进血管侵入，加剧软骨退变。

近年来，单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）技术为研究 KOA 发病机制提供了新视角，但以往的研究单独分析软骨下骨细胞而未考虑软骨细胞，忽略了两者间的相互作用。此外，目前缺乏能准确模拟人类 KOA 病理的动物模型。本研究旨在通过构建双足 KOA 小鼠模型，利用 scRNA-seq 技术明确软骨下骨重塑与软骨退变的相互作用机制，寻找潜在治疗靶点。

研究材料和方法

研究材料

人体样本：收集 5 例接受膝关节置换手术的原发性 KOA 患者的胫骨平台样本，术后立即获取标本并保存于 4% 多聚甲醛中，用于后续微计算机断层扫描（micro-CT）测量和组织学评估。

实验动物：选用 C57 小鼠，分为雄性正常小鼠（MN）、雄性双足小鼠（MB）、雌性正常小鼠（FN）、雌性双足小鼠（FB）、双侧卵巢切除的雌性小鼠（FO）和双侧卵巢切除的雌性双足小鼠（FBO）6 组。双足小鼠在 3 周龄时切除前肢和尾巴，在跑步机上进行低速双足运动训练构建；10 周龄时对部分雌性小鼠进行双侧卵巢切除术。

研究方法

有限元分析（FEA）：使用 Mimics 软件对小鼠膝关节进行三维模型重建，然后分别用 4 节点二次四面体（C3D4）单元和 10 节点二次四面体（C3D10）单元对骨骼和关节软骨进行网格划分。将网格模型导入 Abaqus 进行材料赋值和 FEA 分析，模拟不同组小鼠膝关节在受力时的应变、应力分布以及软骨接触压力。

单细胞 RNA 测序及分析：在 22 周龄时，从每组 5 只小鼠的后肢远端骨骺线分离 10 个不含生长板的股骨髁组织，经清洗、酶解、细胞计数、去除红细胞和死细胞等处理后，通过流式细胞术分选增加 CD45 阴性细胞数量，将 CD45 阳性和阴性细胞按 1:1 混合后进行单细胞 RNA 测序。

关键技术路线

本研究首先构建绝经后双足 KOA 小鼠模型，通过有限元分析验证模型的有效性。在 22 周龄时，对小鼠股骨髁组织进行单细胞 RNA 测序，分析细胞群体和基因表达模式。通过多种实验方法，如细胞免疫荧光染色、共培养实验、体内免疫组化染色等，探究关键细胞亚型在 KOA 发病机制中的作用，具体包括软骨细胞和成骨细胞亚型的鉴定、细胞间相互作用分析以及相关信号通路的研究等。

研究结果

1. 成功构建双足小鼠 KOA 模型

对 6 组小鼠进行不同处理并观察其 KOA 表型。H&E 和 SO&FG 染色显示，FBO 组小鼠关节软骨退行性变化逐渐加重，22 周龄时软骨组织被侵蚀变形，股骨软骨厚度显著降低，OARSI 评分显著增加，细胞外基质主要成分如胶原蛋白 II 和聚集蛋白聚糖的丢失最为明显。透射电镜观察发现 FBO 组小鼠软骨细胞受损，线粒体肿胀、粗面内质网扩张、核周间隙增宽。步态分析表明双足小鼠与正常小鼠步态存在显著差异，FBO 小鼠后肢骨强度明显下降，膝关节间隙变窄，骨赘增多，出现内翻畸形，软骨下骨结构受损。以上结果表明 22 周龄时 FBO 小鼠的 KOA 表型最为明显。

2. KOA 小鼠股骨髁的单细胞转录组学分析

从 6 组小鼠股骨髁分离细胞进行 scRNA-seq 分析，共获得 82,083 个细胞，经严格筛选后保留 65,491 个细胞，分为 15 种细胞类型。通过 AUCell 评分和有限元分析发现，双足小鼠（FB 和 FBO 组）的软骨细胞和骨细胞对机械刺激的反应评分显著高于正常小鼠（FN 组），且双足小鼠膝关节软骨和软骨下骨的机械应力更高，表明该研究成功增加了双足小鼠膝关节的应力强度。

与 FN 小鼠相比，FBO 小鼠的软骨细胞基因表达变化与氧化应激、血管生成、衰老和细胞外基质失调有关；内皮细胞基因表达变化调控了血管异常增殖和软骨下骨病理重塑；成骨细胞基因表达变化促进了成骨细胞发育、血管生成和细胞外基质降解。体外实验证实了这些基因表达变化的结果。

3. Angptl7+ 软骨细胞通过 FGF2-FGFR2 信号通路促进 KOA 小鼠血管生成

对软骨细胞进行亚群分析，发现 AngC-1 和 AngC-2 两种亚型具有促进血管生成的功能，分别高表达 Smoc2 和 Angptl7。进一步研究表明，AngC-2 可能参与 FBO 小鼠软骨下骨血管的异常增殖，与 FN 小鼠相比，FBO 小鼠中 AngC-2 与内皮细胞的相互作用明显增强，且通过 FGF2-FGFR2 相互作用。体外实验中，过表达 ANGPTL7 加剧软骨细胞退变，敲低 ANGPTL7 则减轻退变，且 ANGPTL7 软骨细胞可显著增强人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的血管生成能力，添加 FGFR2 抑制剂后该能力减弱。

4. Sparc+ 成骨细胞负向调节 KOA 小鼠骨矿化和成骨细胞分化

通过轨迹分析发现，来自 FN 和 FBO 样本的前体细胞可分化为不同亚型的成骨细胞和软骨细胞，FBO 样本前体细胞分化过程中负向调节骨矿化的基因表达水平始终高于 FN 样本，且部分细胞的成骨分化相关基因表达水平显著低于 FN 样本，表明 FBO 小鼠软骨下骨矿化和成骨细胞分化受到抑制。成骨细胞自然分为两个亚群，其中 OB5 高表达 Sparc 等基因，与 FBO 小鼠软骨下骨矿化不足和成骨细胞分化异常高度相关。体外实验中，敲低 Sparc 促进成骨细胞样 MC3T3 细胞分化，过表达 Sparc 则抑制其分化。

5. ANGPTL7 和 SPARC 基因表达水平与 KOA 进展呈正相关

对人胫骨平台样本进行免疫组化染色和半定量分析，发现 KOA 组软骨细胞中 ANGPTL7 和骨细胞中 SPARC 的表达水平明显高于正常对照组，且 ANGPTL7 和 SPARC 阳性细胞比例与组织 OARSI 评分呈正相关，表明基因表达水平越高，KOA 进展越严重。

研究结论和讨论

本研究构建了双足 KOA 小鼠模型，并生成了骨软骨复合组织的单细胞图谱。通过单细胞转录组学分析，鉴定出三种新的软骨细胞亚型，即 Smoc2+ 血管生成软骨细胞、Angptl7+ 血管生成软骨细胞和 Col1a1+ 骨生成软骨细胞。其中，Angptl7+ 软骨细胞可通过 FGF2-FGFR2 信号通路与内皮细胞相互作用，促进 H 型血管生长和侵入，H 型血管招募 Osterix+ 成骨祖细胞，促进 KOA 小鼠的骨生成。然而，Sparc+ 成骨细胞在成骨细胞分化和骨矿化过程中功能失调，加重了软骨下骨的病理重塑。这些发现为 KOA 的潜在治疗干预提供了新途径。

不过，研究也存在一些局限性。KOA 小鼠模型构建周期长，3 周龄开始构建双足小鼠模型，10 周龄进行卵巢切除，18 - 22 周龄才出现明显 KOA 表型。单细胞转录组学结果可能仅适用于某些以软骨下骨重塑为特征的 KOA 亚型，不能推广到所有 KOA 亚型。此外，还需要更长的观察期来检测和验证 KOA 小鼠模型中软骨下骨重塑的晚期特征和机制。尽管如此，这项研究为 KOA 发病机制的了解和治疗策略的开发提供了重要依据，有助于推动 KOA 治疗领域的进一步发展。