Phospho-seq技术：单细胞多模态解析神经发育中蛋白质动态与信号通路的革命性工具

研究人员针对神经发育过程中细胞信号传导与分子状态关联的测量难题，开发了名为Phospho-seq的多模态单细胞技术。该研究通过优化抗体偶联方法，实现了对64种细胞内蛋白（含20种磷酸化状态）与染色质可及性（scATAC-seq）的同步检测，并结合实验与计算策略整合转录组数据。应用该技术于视网膜和脑类器官，揭示了Wnt/MAPK信号通路的谱系特异性模式，发现了TEAD1-pRPS6等新型调控关系，为理解神经发育障碍的分子机制提供了新视角。研究成果发表于《Nature Communications》。

　　

在探索生命奥秘的征程中，神经发育过程犹如一部精密编排的交响乐，细胞信号传导蛋白的磷酸化修饰就像乐谱上的音符，调控着每个细胞的命运抉择。然而传统技术面临三大困境：无法同时捕捉磷酸化蛋白动态、染色质状态和基因表达；商业抗体限制大规模细胞内蛋白检测；多模态数据整合存在技术壁垒。这些限制严重阻碍了对自闭症谱系障碍、结节性硬化症等神经发育疾病分子机制的系统解析。

纽约基因组中心和巴塞尔分子与临床眼科研究所的研究团队突破技术瓶颈，开发出Phospho-seq创新平台。这项研究通过优化点击化学偶联方案，实现低成本（每次偶联约8美元）定制化抗体panel构建；建立全细胞兼容的染色质可及性（scATAC-seq）与磷酸化蛋白共检测流程；结合桥接整合（bridge integration）计算策略，成功将视网膜和脑类器官的蛋白质组、表观组和转录组数据有机融合。相关成果发表在《Nature Communications》，为神经发育研究提供了前所未有的多维度解析工具。

关键技术包括：1）基于TCO-PEG4/mTz-PEG4的抗体-DNA偶联技术，可同时检测64种蛋白（含磷酸化状态）；2）全细胞scATAC-seq与细胞内抗体标记兼容方案；3）10x Multiome平台实现RNA-ATAC-蛋白三模态检测；4）SEACells算法进行元细胞分析降低数据稀疏性；5）使用人iPSC来源的视网膜类器官（34周）和脑类器官（3月龄）作为模型系统。

Benchtop conjugation enables antibody panel customization in Phospho-seq
研究团队开发的点击化学偶联方案，通过精确控制抗体与寡核苷酸比例（15 pmol/μg），配合硫酸铵沉淀和50 kDa超滤纯化，使抗体回收率提升40%。流式验证显示，自偶联SOX2抗体的染色指数（Staining Index）达1.26，媲美金标准方法。与ASAP-seq相比，Phospho-seq在pRPS6检测中与流式结果相关性更高（R²=0.90 vs 0.12）。

Phospho-seq simultaneously quantifies phosphorylated, cytoplasmic, and nuclear proteins
在K562/iPSC混合实验中，技术成功区分OCT4⁺（SI=1.22）与GATA1⁺（SI=1.29）细胞群。特别值得注意的是，pSTAT3磷酸化水平（而非总蛋白）与STAT3转录因子活性显著相关，证实磷酸化检测对细胞状态解析的独特价值。研究还发现不同iPSC供体间存在pRPS6表达差异，提示该技术可用于评估细胞系分化倾向。

Intracellular protein staining highlights cell type differences in human retinal organoids
应用46抗体panel分析8,136个视网膜类器官细胞，首次发现视锥细胞比视杆细胞具有更高pRPS6信号（p<0.001），免疫荧光证实这与视锥细胞持续去极化状态的高能量需求相符。SOX9、RCVRN等蛋白标记与染色质开放区域高度一致，且10个TF中有6个其蛋白水平与motif可及性排名相关度>80%。

Extending Phospho-seq to incorporate transcriptomic measurements
比较实验发现，使用10x Multiome虽可实现三模态检测，但ATAC和RNA灵敏度分别降低70%和91%。而通过桥接整合策略，将已发表的scRNA-seq数据与Phospho-seq数据融合，不仅提高注释分辨率（如将"未成熟光感受器"细分为4亚群），还实现转录组全基因组表达谱的准确推算。

Observing signaling network activity with Phospho-seq
在脑类器官中，技术成功捕捉到端脑与间脑谱系间MAPK/ERK信号差异。通过pRPS6-TEAD1共关联分析，发现481个调控元件，其中RPS6KA1（ERK通路）而非RPS6KB1（mTOR通路）的染色质可及性与pRPS6水平相关。在神经胶质亚群中，S100B⁺细胞显示独特pPLCy/pAMPKα信号模式，映射分析提示其可能源自非端脑区域。

Identification of transcriptional co-factors through ADT-motif correlation
突破性发现GLI3需与HD/2家族TF协同调控染色质：在GLI3敲除实验中，仅1.5%的结合位点（含HD/2 motif者富集3.02倍）出现可及性变化。Phospho-seq数据能准确预测这些响应区域（p<0.001），而传统CUT&Tag数据则无法区分功能性结合位点。

Using Phospho-seq data to identify gene regulatory networks in early neurodevelopment
通过SEACells元细胞分析，构建了OTX2等TF的5,033个peak-gene关联网络。足迹分析显示，OTX2蛋白高水平细胞中其motif位点出现典型Tn5切割缺失。特别发现STAT3磷酸化水平在胶质细胞中升高，其582个靶基因包含AQP4等星形胶质细胞标记物，证实了技术在解析神经胶质分化机制中的价值。

这项研究建立的Phospho-seq技术体系，首次实现单细胞水平磷酸化蛋白动态与表观遗传调控的同步解析。不仅揭示Wnt-Hippo通路串扰等新型调控机制，更通过GLI3-HD/2协同作用等发现，重新定义转录因子功能分类标准。提供的开源生物信息流程（Seurat/Signac）和已验证抗体panel（Supplementary Data 1），将加速神经发育、癌症等领域的信号网络研究。未来与空间组学、CRISPR筛选等技术结合，有望绘制更完整的细胞命运决定图谱。