布氏锥虫发育调控因子RBP6无序区的深度突变扫描揭示正电荷残基对关键无序区域的影响

本研究通过深度突变扫描(DMS)技术系统解析了布氏锥虫发育调控因子RBP6的功能结构域，发现其N端无序区(N-IDR)对正电荷残基敏感，而C端RNA识别基序(RRM)对突变高度敏感。研究揭示了RBP6通过RRM介导RNA互作，并通过N-IDR调控发育进程的分子机制，为理解锥虫发育转换提供了新视角。

　　

在非洲大陆，由布氏锥虫(Trypanosoma brucei)引起的人类和动物锥虫病长期困扰着当地居民。这种单细胞寄生虫通过采采蝇传播，其复杂的生命周期涉及从昆虫载体到哺乳动物宿主的形态转换过程。在这一过程中，RNA结合蛋白6(RBP6)被证实是调控锥虫发育的关键开关，能驱动非感染性的前循环形式分化为具有感染性的后循环形式。然而，科学家们对RBP6的功能结构域及其突变限制仍知之甚少，这限制了对锥虫发育调控机制的深入理解。

来自耶鲁大学医学院的研究团队在《Nature Communications》发表了突破性研究成果。他们采用深度突变扫描(DMS)技术，系统分析了RBP6全长的功能图谱，揭示了其结构特征与发育调控的分子机制。研究通过构建包含所有单点突变的RBP6突变体文库，在前循环形式中表达后筛选感染性后循环形式，结合生物信息学分析和功能验证实验，阐明了RBP6各结构域的功能特性。

关键技术方法包括：1)PCR介导的密码子突变构建全突变文库；2)布氏锥虫29-13前循环细胞系的遗传操作；3)基于柱层析的后循环形式纯化技术；4)高通量测序分析突变频率变化；5)AlphaFold2蛋白质结构预测；6)UV交联实验验证RNA结合活性。研究样本来源于布氏锥虫Lister 427株。

Deep mutational scanning of RBP6 reveals domain architecture

通过深度突变扫描技术，研究人员发现RBP6的C端包含一个非典型的RNA识别基序(RRM)，其β折叠片显示出极高的突变敏感性。与此形成鲜明对比的是，N端无序区(N-IDR)对突变表现出更强的耐受性。突变频率分析显示，RRM区域特别是β1和β3链上的RNP基序对突变最为敏感，这支持了RRM在RNA靶标识别中的关键作用。

An essential role for the N-IDR in RBP6 function

研究发现N-IDR虽然整体上突变耐受性较高，但存在9个关键位点集中了该区域33%的有害突变。引人注目的是，在N-IDR中引入正电荷残基(如F2K、M76K等)会显著改变正常的发育模式，导致后循环形式提前出现但数量减少。而组合突变(F2K/L45K/M76K)则产生叠加效应，既能加速发育又能维持后循环形式的持续产生。

Mutation-intolerant residues cluster in RRM β-strands

结构分析表明，RRM中突变最敏感的残基主要位于β折叠片，特别是RNP1和RNP2基序。功能验证实验证实，β1链上的L147R和β3链上的F185L突变会严重影响RBP6的稳定性和功能。这些结果支持RRM通过其β折叠片介导与RNA靶标的特异性相互作用。

Aromatic substitutions at E165 enhance differentiation

研究发现RRM中带负电残基(如E165)被芳香族氨基酸取代会产生显著的有益效应。表达E165Y等突变体的锥虫表现出加速且增强的发育进程，与野生型相比能产生更多的后循环形式。当与N-IDR突变(F2K)组合时，这种效应进一步增强。

这项研究首次绘制了RBP6全长的功能图谱，揭示了其通过RRM和N-IDR协同调控锥虫发育的分子机制。RRM的高度保守性表明其在RNA靶标识别中的核心作用，而N-IDR的突变敏感位点则暗示其可能作为环境感应器调控发育进程。特别值得注意的是，研究发现通过合理设计特定位点的突变(如E165Y和F2K组合)，可以显著增强RBP6的发育调控功能，这为开发干预锥虫发育的新策略提供了分子靶点。该成果不仅深化了对锥虫发育调控的认识，也为研究其他RNA结合蛋白的结构-功能关系提供了范式。