流感疫苗接种与感染后多克隆IgG对血凝素（HA）应答的结构图谱解析

本研究运用负染电镜多克隆表位定位技术（nsEMPEM），首次系统绘制流感疫苗接种与自然感染人群对血凝素（HA）的多克隆IgG应答图谱。揭示保守中央茎区（central stem）表位在两类人群中的广泛靶向性（H1亚型占比>85%，H3亚型>70%），并发现疫苗可诱导更丰富的表位多样性（平均4.2个/人 vs 感染组2.6个）。这些发现为通用流感疫苗设计提供了关键结构免疫学依据，强调需深入解析保守表位（如锚定表位/anchor）的防护机制。

　　

专业内容归纳

ABSTRACT

采用负染电镜多克隆表位定位（nsEMPEM）技术，对季节性四价流感疫苗接种者或甲型流感病毒（IAV）感染者的血清多克隆IgG靶向血凝素（HA）表位进行结构解析。结果显示：

1. 疫苗接种组与感染组均靶向H1/H3亚型HA的保守区域（中央茎区/锚定表位）

2. H1应答主要集中于中央茎区（感染组占比78±12%，疫苗组82±9%），H3则更多靶向头部表位

3. 疫苗组表位多样性显著高于感染组（H1平均4.5个 vs 2.8个；H3平均3.8个 vs 2.4个）

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INTRODUCTION

• 历史背景：1918 H1N1大流行促使公共卫生体系改革，幸存者抗体对2009 H1N1具有交叉保护作用

• 免疫靶点：HA（19亚型）与神经氨酸酶（NA，11亚型）是核心靶标，HA因表面丰度高成为疫苗设计焦点

• 疫苗困境：HA头部表位易发生抗原漂移（antigenic drift），导致疫苗效力波动（近年有效率17-60%）

• 突破方向：保守中央茎区表位可引发广泛中和抗体（如阻断膜融合、激活Fc效应功能）

• 技术革新：EMPEM克服传统竞争ELISA局限，实现多表位同步定位

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RESULTS

感染患者普遍靶向H1/H3中央茎区

• 队列特征：7例急诊患者（4例H1N1，3例H3N2），症状出现1-7天

• 关键发现：

  • 100%患者存在H1/H3中央茎区应答

  • H1头部应答率71%（5/7），H3头部应答率71%（5/7）

  • 仅3例检测到H3侧头部/退化酯酶表位

疫苗接种者表位多样性更显著

• 队列设计：10名Flucelvax^?四价疫苗接种者（含H1/H3类似株）

• 动态变化：

  • 基线日（day 0）即存在中央茎区应答（H1：90%，H3：80%）

  • 接种后14天，7/10受试者出现新表位（如H3退化酯酶表位）

  • 表位数量：H1从平均3.2增至4.5，H3从2.9增至3.8

血清学与结构数据关联

• ELISA：疫苗组H1 AUC较感染组高250%（P<0.01），H3高180%（P<0.05）

• 电镜粒子分布：

  分组	H1中央茎区结合率	H3中央茎区结合率
  感染组	76±18%	52±22%
  疫苗组day0	68±15%	47±19%
  疫苗组day14	85±9%	63±14%

• 血凝抑制（HAI）：中央茎区抗体可通过空间位阻抑制血凝（患者4/6未检出头部应答但HAI阳性）

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DISCUSSION

保守表位的防护意义

• 中央茎区应答与年龄正相关（r=0.73），反映反复抗原暴露积累

• 急诊患者普遍存在茎区抗体但仍发病，提示：

  1. 抗体水平不足（ELISA AUC仅为疫苗组25-40%）

  2. 靶向非保护性表位（如HA¹茎区非功能域）

  3. 效应功能缺陷（需补体C1q/FcγR协同）

表位动态演化机制

• 感染早期：记忆B细胞优先分化为短寿命浆细胞（extrafollicular response），主导急性期应答

• 疫苗接种：低亲和力B细胞可进入生发中心（GC）经历体细胞高频突变（SHM），增加表位多样性

• 异常案例：疫苗组6号受试者day14丢失H3茎区应答，或反映GC选择偏好

技术局限与展望

1. 样本量小（n=17），需扩大验证

2. Fab制备损失IgG亲合力（avidity）效应

3. 未来需结合单B细胞测序与冷冻电镜（cryo-EMPEM）解析抗体克隆性

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MATERIALS AND METHODS

• 样本来源：

  • 疫苗组：范德堡大学IRB批准，Flucelvax^?接种者血清（day0/day14）

  • 感染组：急诊科确诊IAV患者血浆（EDFLU研究，IRB#2017-10-220）

• nsEMPEM流程：

  1. 血清IgG→木瓜蛋白酶消化→Fab纯化

  2. HA-Fab复合物负染（2%乙酸双氧铀）

  3. Relion 3.0处理10-40万颗粒，分辨率20-30?

• 血清学检测：

  • ELISA：抗HA-IgG AUC分析

  • HAI：火鸡红细胞法（1%悬液）

  • 微量中和：100TCID₅₀病毒+MDCK细胞

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结论启示

本研究建立流感多克隆应答的结构评估基准，证实：

1. 保守表位优势：中央茎区是跨暴露途径的核心靶标

2. 疫苗设计启示：增强茎区应答质量（非仅数量）是通用疫苗关键

3. 技术应用前景：EMPEM可整合至大规模疫苗临床试验评估体系