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DNA 复制应激反应机制未完全明晰。研究人员开发 Replication-IDentifier（Repli-ID）技术，研究酵母 DNA 复制调控因子。发现 423 个相关基因，明确 LGE1 和 ROX1 作用机制。该技术为解析 DNA 复制应激反应提供新途径。
在生命的微观世界里，细胞的 DNA 复制过程至关重要，它就像精密的生产线，一丝差错都可能引发严重后果。然而，这条 “生产线” 时常面临挑战，诸如羟基脲（HU）导致的 dNTP 耗尽等情况，会使复制叉停滞或崩溃，进而触发细胞的复制应激反应。这一反应对稳定复制叉、激活细胞周期检查点以及诱导 DNA 损伤反应基因的表达起着关键作用。尽管目前已知一些因素参与其中，但整个调控网络仍迷雾重重，许多参与蛋白尚未被发现。为了揭开这些谜团，来自莱顿大学医学中心（Leiden University Medical Center）和于默奥大学（Ume? University）等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。
为了深入探究 DNA 复制应激反应的调控机制，研究人员开发了一种名为 Replication-IDentifier（Repli-ID）的创新技术。这一技术主要基于染色质免疫沉淀（ChIP）与条形码筛选方法，能够在全基因组范围内对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的 DNA 复制调控因子进行识别。其核心原理是通过追踪复制性聚合酶 ε（Pol ε）在带有条形码的复制起点处的结合情况，来判断复制叉的稳定性和进程。研究人员构建了包含约 4500 个带条形码突变体和 1100 个野生型对照的文库，利用 ChIP 结合下一代测序技术，分析在 HU 诱导的复制应激条件下，不同突变体中 Pol ε 的结合水平。
在研究结果部分，首先，研究人员成功验证并建立了 Repli-ID 技术体系。他们发现，ARS404 是一个晚期启动的复制起点，通过过表达不能被 Rad53 磷酸化的 sld3 - 38A dbf4 - 4A 突变体，能够有效促进 ARS404 的启动，并使 Pol ε 在该起点处高效结合。对构建的 Repli-ID 文库进行验证时，发现缺失 Sgs1 会导致在 HU 存在下，S 期 Pol ε 结合减少，这与先前研究结果一致，证明了该技术的可靠性。
其次，利用 Repli-ID 技术，研究人员进行了两次独立筛选，获得了高质量的数据集。最终确定了 423 个基因，其缺失会导致 Pol ε 在复制起点附近的积累减少，这意味着这些基因可能参与了复制叉稳定性或进程的调控。进一步分析发现，这些基因在染色质组织、液泡运输和内体运输等生物学过程中显著富集。同时，还发现了 128 个基因，其缺失会使 Pol ε 水平升高，以及一些在特定时间点影响 Pol ε 水平的基因，这些基因的发现为深入研究 DNA 复制调控提供了丰富的线索。
然后，研究人员对新发现的影响复制叉稳定性 / 进程的因子进行了验证。在随机挑选的突变体中，如 tpa1Δ、cse2Δ、rec8Δ 等，通过 ChIP - qPCR 实验证实了它们确实会导致 Pol ε 水平下降，与 Repli-ID 筛选结果相符。此外，还发现一些突变体，如 fpr4Δ 和 apt1Δ，在无 HU 条件下也会影响 Pol ε 结合，表明它们对复制叉的影响独立于复制应激。
接着，深入研究 Lge1 和 Rox1 这两个关键因子的作用机制。Lge1 作为 Bre1 的辅助因子，能够促进 H2B 在赖氨酸 123 位点的单泛素化（H2Bub）。研究发现，缺失 Lge1 会导致 H2Bub 水平显著降低，进而影响复制起始和 / 或叉稳定性，使 DNA 合成延迟。在细胞周期分析中，也发现缺失 Lge1 会导致细胞进入 S 期的进程受阻。此外，Lge1 还在检查点激活和叉恢复过程中发挥重要作用，缺失 Lge1 会导致 Rad53 磷酸化延迟，影响细胞对复制应激的恢复能力。
Rox1 作为转录抑制因子，对 DNA 复制的调控机制较为复杂。研究发现，缺失 Rox1 会导致 Pol ε 水平显著下降，影响 DNA 合成。起初，研究人员猜测 Rox1 可能通过调节 dNTP 水平影响 DNA 复制，但实验结果显示，缺失 Rox1 并未显著改变 dNTP 水平。进一步研究发现，Rox1 通过抑制 Sur2 的表达来调控细胞对复制应激的反应。Sur2 编码的酶参与鞘脂的合成，Rox1 缺失会导致 Sur2 过表达，进而影响神经酰胺的水平。神经酰胺能够激活 PP2A 磷酸酶，抑制 Rad53 磷酸化，影响细胞周期进程和检查点激活。通过一系列实验，研究人员证实了 Rox1 通过调节 Sur2 / 神经酰胺依赖的途径，控制 S 期进入和检查点激活，从而影响 DNA 复制。
在研究结论和讨论部分，Repli-ID 技术的开发为研究 DNA 复制应激反应提供了强大的工具，它能够在全基因组范围内快速、高效地识别相关调控因子，为后续深入研究这些因子的作用机制奠定了基础。通过对 Lge1 和 Rox1 的研究，揭示了表观遗传和代谢途径在 DNA 复制应激反应中的重要调控作用。Lge1 通过促进 H2B 单泛素化影响复制起始、稳定性和恢复，而 Rox1 通过抑制 Sur2 调节神经酰胺水平，进而调控检查点激活和 S 期进入。这些发现不仅丰富了我们对 DNA 复制应激反应调控网络的认识，也为理解相关疾病的发生机制提供了新的视角。例如，人类同源蛋白 WAC 与 Lge1 功能相似，研究 WAC 在人类细胞中的作用，可能有助于揭示某些发育疾病与 DNA 复制异常之间的关系。此外，Rox1 与哺乳动物转录因子 SRY/Sox 蛋白在结构上具有相似性，研究它们在神经酰胺产生和 PP2A 激活方面的功能联系，可能为癌症治疗策略的优化提供新的思路。
总之，这项研究成果为生命科学领域对 DNA 复制应激反应的研究开辟了新的道路，Repli-ID 技术的广泛应用有望推动相关领域取得更多重要突破，为人类健康医学研究带来新的机遇和希望。
