Nature Methods：用甘聚糖结合荧光团对细胞外基质进行实时成像

Rhobo6是一种细胞不渗透的小分子荧光团，它与聚糖显示可逆的荧光结合，使其成为活样品中细胞外基质的通用、免水洗和非扰动标记。

　　

新型荧光团 Rhobo6：细胞外基质活体成像的创新工具

近日，霍华德休斯医学研究所珍妮莉亚研究园区（Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute）的 Antonio Fiore、Guoqiang Yu 等研究人员在《Nature Methods》杂志上发表了题为 “Live imaging of the extracellular matrix with a glycan-binding fluorophore” 的论文。该研究开发了一种名为 Rhobo6 的细胞不可渗透的小分子荧光团，为细胞外基质（ECM）的活体成像提供了一种简单、有效的新方法，有助于降低细胞外生物学研究的门槛，对深入了解 ECM 的结构和功能具有重要意义。

一、研究背景

细胞外基质在多细胞系统中发挥着至关重要的作用，它参与生物化学和机械信号传导，对组织的发育、维持和疾病进展具有深远影响。例如，ECM 刚度的局部增加能够影响乳腺上皮的整体发育方向；ECM 的机械压实足以驱动工程组织的折叠；细胞表面糖基化异常则与肿瘤的免疫逃逸和转移密切相关。在这些过程中，ECM 生物分子的三维排列随时间的变化对其功能起着关键作用，因此，对活体组织中 ECM 进行成像研究一直是生物学领域的重要课题。

然而，目前用于荧光标记细胞外生物分子的方法在活体组织应用中存在诸多挑战。基于蛋白质的亲和试剂（如抗体和凝集素），由于空间扩散性差，难以在组织中有效分布；病毒递送标记的高分子量 ECM 成分，受到病毒包装限制；内源性遗传标签则需要大量优化，以避免干扰 ECM 的正常组装，而这对于生物体的发育至关重要。此外，现有方法难以实现多重标记，无法全面展示 ECM 的结构，且存在细胞毒性等问题。因此，开发一种简单、高效、非侵入性的 ECM 活体成像方法迫在眉睫。

二、研究材料与方法

（一）材料

研究中使用了多种细胞系，包括 MCF10A、PC - 3、4T1 等，以及多种实验动物，如小鼠、果蝇、线虫、斑马鱼和拟南芥等。同时，还使用了各种 ECM 成分，如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚集蛋白聚糖、透明质酸等，以及多种荧光标记试剂和抗体。

（二）方法

1. 合成与表征：通过一步还原胺化反应合成 Rhobo6，并对其进行了全面的光物理表征，包括吸收光谱、发射光谱、量子产率、荧光对比度等。利用有机合成和化学表征技术，确定了 Rhobo6 的结构和纯度。

2. 体外和细胞实验：使用纯化的 ECM 成分和细胞系，评估 Rhobo6 的标记特性，如特异性、亲和力、结合动力学等。通过糖微阵列实验，研究 Rhobo6 对不同聚糖的结合特异性；利用表面等离子共振技术，测定其与 ECM 成分的结合亲和力。

3. 组织和动物实验：对小鼠胚胎唾液腺、成年小鼠胰腺、肌肉等组织进行标记和成像，评估 Rhobo6 在复杂组织中的性能，包括生物相容性、组织穿透性、信号稳定性等。在动物实验中，通过眼眶后注射 Rhobo6，研究其在体内的分布和对 ECM 的标记效果。

4. 成像技术：采用共聚焦显微镜、荧光寿命成像显微镜（FLIM）、二次谐波生成显微镜、双光子激发显微镜、受激发射损耗显微镜（STED）等多种成像技术，对标记的样品进行观察和分析。

（三）关键技术路线

研究人员基于硼酸与聚糖中 1,2 - 和 1,3 - 二醇可逆结合的原理，设计合成了 Rhobo6。通过在罗丹明 - 110 衍生的硼凝集素 Rhobo 的基础上引入羧基，使其具有细胞不可渗透性。在与聚糖结合后，Rhobo6 的荧光增强并发生红移，从而实现对 ECM 的可视化。研究人员对 Rhobo6 进行了全面的光物理表征，并在体外、细胞、组织和动物水平上进行了广泛的实验验证，以评估其标记性能和应用潜力。

三、研究结果

（一）探针设计与光物理表征

研究人员对 Rhobo6 进行了系统的光物理表征。在无二醇的缓冲液中，Rhobo6 的吸收和发射最大值相对于母体染料 6 - 羧基罗丹明 110 有大约 20nm 的位移，与二苄基罗丹明的值相近。当加入饱和浓度的糖醇山梨醇形成二醇结合形式时，其摩尔吸光系数、量子产率增加，吸收峰红移 13nm，发射峰红移 14nm。以 561nm 激光激发，575nm 长通发射滤光片检测时，体外荧光变化（ΔF/F）可达 7.3，具有良好的荧光对比度。此外，Rhobo6 的双光子激发光谱在结合二醇后增强，且其对二醇的亲和力随 pH 升高而增加。通过对 PC3 细胞的实验，证实了 Rhobo6 相对于 Rhobo 具有显著降低的细胞渗透性，减少了细胞内染料积累，避免了对细胞外信号的干扰。

（二）纯化聚糖和 ECM 成分的标记谱

在糖微阵列实验中，100 种聚糖中有 98 种与阴性对照相比，Rhobo6 的结合有统计学显著增加，表明其对聚糖和糖结合物具有广泛的特异性。对带负电荷结构的聚糖结合较低，可能是由于电荷排斥作用。将 Rhobo6 应用于纯化的 ECM 成分，包括纤维状糖蛋白、网络形成糖蛋白、蛋白聚糖和多糖等，均观察到荧光对比度。其中，透明质酸的信号最弱，可能与其缺乏凝聚结构有关。用高碘酸钠预处理破坏 1,2 - 二醇，或用糖苷酶软骨素酶预处理，均会降低 Rhobo6 对相应 ECM 成分的标记，表明其荧光对比度依赖于聚糖的存在。通过对胶原蛋白 I 凝胶的光谱成像，证实了结合态和游离态 Rhobo6 的存在，且结合态染料分子的激发最大值发生红移。以胶原蛋白 I 为底物，测量 Rhobo6 结合的平衡常数，得到其结合速率常数（kon）为 12.8 M?1s?1，解离速率常数（koff）为 6.77×10?? s?1，表观解离常数（Kd）为 53 μM。在 5 μM Rhobo6 浓度下，达到最大信号 50% 的时间约为 15 分钟，60 分钟时可达到 90% 以上的信号，因此确定生物样品的孵育时间为 1 小时。以包被的聚集蛋白聚糖为底物，在 9 小时的成像过程中未观察到荧光损失，表明 Rhobo6 具有良好的抗光漂白性。

（三）细胞表面的聚糖依赖性标记

在永生乳腺上皮细胞系 MCF10A 中，通过强力霉素诱导表达大量 O - 糖基化的跨膜蛋白 MUC1ΔCT，可调节细胞表面糖基化程度。实验结果表明，Rhobo6 对细胞表面的标记依赖于 MUC1 的表达，用粘蛋白选择性蛋白酶预处理细胞可消除该信号。添加 200 mM 山梨醇或含血清培养基会降低 MUC1 依赖性信号，说明 Rhobo6 的结合具有二醇依赖性和可逆性。对表达 MUC1 的细胞进行 FLIM 成像，可区分游离态（2 ns）和结合态（3.5 ns）的 Rhobo6，进一步证实了其结合特性。

（四）在切除组织中的 Rhobo6 基准测试

对小鼠胚胎唾液腺进行研究，发现 Rhobo6 对其生长和形态发生无影响，表明其具有良好的生物相容性。用 6 - 羧基罗丹明 110 和 Rhobo6 对唾液腺进行双色成像，结果显示 6 - 羧基罗丹明 110 仅填充细胞外空间，而 Rhobo6 可揭示围绕上皮芽和间充质细胞的纤维状物质网络。与细胞可渗透的 Rhobo 相比，Rhobo6 能特异性标记 ECM 结构，而 Rhobo 因被细胞不可逆摄取而无法有效标记 ECM。在血清存在的情况下，Rhobo6 仍能对唾液腺 ECM 进行标记，说明血清主要限制的是细胞表面聚糖的成像，而非 ECM 的标记。通过与荧光标记的蛋白质亲和试剂共染，发现 Rhobo6 信号与抗胶原蛋白 IV 抗体、抗层粘连蛋白抗体和 CNA35（一种与纤维状胶原蛋白结合的蛋白）有共定位，表明其标记的 ECM 成分与这些已知的 ECM 蛋白存在关联。

对成年小鼠胰腺组织进行染色，Rhobo6 可在一步、免洗的方案下，清晰标记筋膜和嵌入的细胞核。与抗胶原蛋白 I 抗体共染，进一步证实了 Rhobo6 能标记胰腺导管、表面筋膜和间质基质，展示了其在复杂组织中标记 ECM 的能力。将 Rhobo6 应用于全小鼠股四头肌，可在未接触染料的组织横截面实现 ECM 标记，证明其具有快速的组织穿透和染色能力。对脱细胞的小鼠肾脏和心脏组织进行标记，Rhobo6 能成功标记 ECM 成分，且与 Hoechst 染色结果显示细胞物质已被有效去除，表明其适用于脱细胞组织的 ECM 成像。利用 STED 显微镜对新鲜切除的小鼠胰腺组织进行成像，证实了 Rhobo6 与超分辨率成像技术的兼容性，能够提供更高分辨率的 ECM 结构信息。

（五）Rhobo6 在非哺乳动物模型生物中的应用

在果蝇、线虫、斑马鱼和拟南芥等非哺乳动物模型系统中，研究人员评估了 Rhobo6 的性能。在果蝇大脑中，Rhobo6 可标记神经元细胞周围的结构，且通过双色成像证实其不进入细胞内部；在线虫中，注射 Rhobo6 后可标记卵黄、蛋壳、外阴等结构，且信号集中在输卵管内的特定部位，而非细胞质中；在斑马鱼幼虫中，通过在伤口愈合过程中对其尾部进行标记，可观察到 ECM 结构成分；在拟南芥幼苗中，Rhobo6 信号定位于根细胞表面，与之前代谢掺入叠氮单糖的分布一致。这些结果表明，Rhobo6 适用于多种生物样品的免洗标记，具有广泛的应用前景。

（六）肿瘤驱动的 ECM 重塑成像

在小鼠乳腺癌细胞系 4T1 的球体侵袭实验中，研究人员发现培养基中存在 Rhobo6 不影响球体的侵袭潜力，进一步证明了其生物相容性。通过双光子成像和纤维取向分析，发现侵袭区域的 ECM 纤维与突出细胞平行排列，而非侵袭区域则无定向偏好，这与先前关于肿瘤侵袭与 ECM 纤维取向关系的研究结果一致。在小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）驱动的多瘤中间 T 抗原（PyMT）小鼠乳腺癌模型中，通过活体成像发现，野生型小鼠的 ECM 结构在 Rhobo6 标记下呈现出围绕导管上皮和间质脂肪细胞之间的纤维状结构；而在 PyMT 小鼠中，ECM 结构发生显著改变，在腺瘤 / 乳腺上皮内瘤变或早期癌阶段，恶性病灶周围有厚的基底膜，病灶间 ECM 增多；在更晚期的癌阶段，肿瘤结节周围形成篮状的纤维状 ECM 网络，许多纤维与肿瘤边缘垂直排列。对成像后的乳腺组织进行组织学分析，免疫荧光标记肌动蛋白和细胞核，以及与 CNA35 标记结果对比，进一步证实了 Rhobo6 在体内标记 ECM 的有效性，以及在活体成像中区分肿瘤相关 ECM 和健康 ECM 结构的能力。

四、研究结论与讨论

研究人员成功开发了一种细胞不可渗透的小分子荧光团 Rhobo6，它通过与聚糖可逆结合实现荧光开启和红移，为 ECM 的活体成像提供了一种简单、高效的方法。Rhobo6 具有以下重要特性：

1. 细胞不可渗透性：避免了细胞内染料积累，确保了细胞外信号的准确性，但也限制了其在化学固定或细胞膜受损样品中的应用，除非进行脱细胞处理。

2. 低亲和力与可逆结合：硼酸基团对单糖的亲和力较低，在生物样品中，高局部有效摩尔浓度的聚糖驱动了其标记模式。这种可逆、低亲和力的结合方式对天然 ECM 结构扰动小，且具有抗光漂白性，有利于长期研究 ECM 动态变化。此外，其结合具有可逆性，通过缓冲液交换可实现多次标记和光谱复用。

3. 广泛的标记特异性：Rhobo6 不针对某一种聚糖或 ECM 成分具有特异性，而是广泛标记 ECM 中的糖结合物，其标记强度受多种因素影响。在研究 ECM 的结构和机械性能（如纤维取向）时，Rhobo6 可提供定量测量；而在需要了解 ECM 组成的分子信息时，它可作为起点，后续结合更具特异性的工具进行研究。

尽管 Rhobo6 在 ECM 成像方面取得了重要进展，但仍有进一步改进的空间。未来的研究可以致力于赋予其聚糖选择性、增强氧化稳定性和优化光谱特性。此外，深入研究 Rhobo6 在二醇存在下荧光增强和光谱移动的机制，将有助于更好地设计和优化此类荧光团。在应用方面，除了本文中展示的成像和数据分析方法，还可以探索将低浓度的 Rhobo6 应用于 PAINT 显微镜，实现纳米级精度的单分子定位；利用机器学习对 Rhobo6 标记的 ECM 成分进行注释，提供更多分子信息。同时，研究人员还设想将 Rhobo6 或其类似物开发为活检样本的诊断工具、用于诊断成像或荧光引导手术，但这需要进一步研究染料的药代动力学和临床环境中的荧光对比度。

综上所述，Rhobo6 的开发为细胞外生物学研究提供了有力的工具，有望推动对 ECM 结构和功能的深入理解，促进相关领域的发展。