利用基因组测序和剪接技术鉴定大疱性结性表皮松解症的深层内含子变异

　　

基因测序与剪接分析揭示交界性大疱性表皮松解症的深层内含子变异

复旦大学附属儿科医院皮肤科的研究人员联合其他单位，在npj Genomic Medicine期刊上发表了题为 “Identification of deep intronic variants in junctional epidermolysis bullosa using genome sequencing and splicing assays” 的论文。该研究通过全基因组测序和剪接分析，鉴定出交界性大疱性表皮松解症（JEB）患者的深层内含子变异，为该疾病的基因诊断提供了新见解，有助于完善 JEB 的遗传诊断体系，推动精准医疗发展，对提高疾病诊断准确性、优化临床管理意义重大。

一、研究背景

JEB 是一类遗传性创伤性皮肤和黏膜水疱病，与多个基因的隐性变异相关，如编码 XVII 型胶原蛋白的 COL17A1 基因，编码整合素 α6β4 的 ITGA6 和 ITGB4 基因，以及编码层粘连蛋白 332 的 LAMA3、LAMB3 或 LAMC2 基因。严重的 JEB 主要由 LAMA3、LAMB3 或 LAMC2 基因中的提前终止密码子（PTC）变异引起，而 COL17A1 基因变异则与局限性或中间型 JEB 相关。

此前研究中，通过外显子组测序（ES）仍有部分 JEB 病例无法明确遗传诊断。在作者团队的前期研究里，约 4.8% 的隐性大疱性表皮松解症（EB）病例和 10.7% 的隐性 JEB 病例因仅在目标 EB 基因中鉴定出一个致病等位基因而无法明确诊断 。其他研究报道中，0%-5.9% 携带 COL17A1 变异的 JEB 病例无法通过 ES 进行遗传诊断，但该研究团队发现，在由 COL17A1 变异引起的病例中，这一比例高达 31.6%。ES 主要聚焦于蛋白质编码区域，可能遗漏非编码区域的变异，如启动子、调控非翻译区或深层内含子序列。有害的 DNA 变异若位于距外显子 - 内含子交界 100 - 150bp 处，常通过激活非规范剪接位点或改变剪接调控元件导致假外显子插入。基于此，研究人员推测 JEB 病例中未明确的第二个致病等位基因可能是深层内含子变异，故而开展此项研究。

二、研究材料与方法

（一）研究对象

研究人员从皮肤科门诊和 Debra 上海中心招募了 69 例隐性 JEB 患者。通过标准临床皮肤科检查，包括影像学、皮肤活检等进行临床诊断。所有患者及家属均按照赫尔辛基宣言原则招募，研究获得复旦大学附属儿科医院伦理委员会批准，且所有受试者或其监护人都签署了知情同意书。

（二）实验方法

1. 外显子组测序（ES）和 Sanger 测序：使用商业试剂盒从 69 例患者外周血样本中提取基因组 DNA，由上海韦翰斯生物医药科技有限公司进行测序。ES 分析时，利用 Illumina HiSeq2000 平台富集并测序目标外显子，去除低质量和重复序列，与 hg19 人类基因组参考序列比对识别遗传变异，使用多种预测工具评估变异影响，并依据 ACMG/AMP 分类系统对候选变异分类。Sanger 测序用于验证可能的致病变异。

2. 基因组测序（GS）：对 6 例受影响个体（1 例携带 LAMB3 变异，5 例携带 COL17A1 变异）进行 GS，在 LAMB3 基因（Pat.13）和 COL17A1 基因（Pat.52、Pat.53、Pat.57、Pat.61、Pat.65）中寻找潜在深层内含子变异，之后用 Sanger 测序验证。

3. 剪接分析：构建含目标变异的迷你基因，转染 HaCaT 细胞和 HEK293 细胞。转染后提取 RNA 进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），纯化 PCR 产物并测序。对产生多种剪接产物的变异进行克隆测序。

4. 免疫组织化学：对福尔马林固定、石蜡包埋的皮肤切片进行免疫组化染色，检测胶原蛋白 XVII（COL17A1）水平，观察皮肤组织中相关蛋白表达情况。

三、研究结果

（一）JEB 患者的分子特征

69 例患者经 ES 测序，发现 3 例由 LAMA3 变异引起，24 例由 LAMB3 变异引起，9 例由 LAMC2 变异引起，14 例由 ITGB4 变异引起，19 例由 COL17A1 变异引起。然而，9 例（1 例 LAMB3、2 例 ITGB4 和 6 例 COL17A1 相关病例）遗传诊断仍不明确。例如，Pat.13 临床诊断为隐性 JEB，但 ES 仅检测到 LAMB3 基因的一个杂合变异；Pat.52、Pat.53 等 6 例临床表型与 COL17A1 基因变异相关的患者，ES 也仅发现一个杂合变异。

（二）LAMB3 基因的新变异

对 Pat.13 的 LAMB3 基因筛查发现一个位于 5' 非翻译区（UTR）的新变异 c.-38 + 2 T>C，该变异距编码区约 1400bp，人群数据库中未出现，预测会导致异常转录本。迷你基因分析显示，该变异在 HEK293 细胞和 HaCaT 细胞中均诱导产生比野生型更大的条带，测序表明其导致 120bp 内含子的框内假外显子插入。对 Pat.13 血液 cDNA 分析发现，c.-38 + 2 T>C 和 c.28+1 G>A 变异致使 LAMB3 表达缺失。

（三）COL17A1 基因的深层内含子变异

通过 GS 在 COL17A1 基因中检测到 3 个新的深层内含子变异。Pat.52、Pat.57 和 Pat.65 携带 c.4156+117 G>A 变异，该变异位于内含子 52，产生两种异常转录本，导致外显子跳跃和移码，使胶原蛋白 XVII 水平降低，影响半桥粒结构，且在 5 例患者中有 3 例携带，可能是中国 JEB 患者中常见的变异。Pat.53 携带的 c.2039-104 G>A 变异位于内含子 25，导致 171bp 假外显子插入；Pat.61 的 c.1267+237dupC 变异导致外显子 16 和 17 跳跃。值得注意的是，HEK293 细胞转染这些变异后未显示剪接缺陷，而在 HaCaT 细胞中则出现了相应的剪接异常。

四、研究结论与讨论

研究通过对 69 例隐性 JEB 患者的研究，运用 GS 和剪接分析，在 6 例患者中鉴定出 4 个深层内含子变异，其中 c.4156+117 G>A 可能是中国 JEB 患者 COL17A1 基因常见的深层内含子变异。这表明 GS 可作为 ES 的补充方法，用于检测 ES 无法发现的变异，尤其是当 ES 已检测到目标基因中一个致病、可能致病或意义未明变异时，GS 有助于明确诊断。

不同细胞系对变异剪接效应的检测存在差异。HEK293 细胞可能因缺乏皮肤特异性剪接蛋白，无法有效识别由 COL17A1 基因深层内含子变异产生的新剪接位点，而 HaCaT 细胞则能显示出相关剪接缺陷。因此，在 mRNA 分析中选择合适的细胞系至关重要，使用皮肤细胞系和优化的 mRNA 分析标准方案可提升诊断准确性。

本研究揭示了 JEB 患者中深层内含子变异的存在，为该疾病的遗传诊断提供了新依据，强调了 GS 在疑难病例诊断中的重要性。未来，针对特定基因的靶向深层内含子测序，尤其是对 COL17A1 基因 c.4156+117 G>A 变异的检测，有望成为 JEB 遗传诊断的重要手段，推动 JEB 精准诊断和个性化治疗的发展，对提高患者生活质量、改善疾病预后具有重要的临床意义 。