深度视觉蛋白质组学揭示DNA复制应激是印戒细胞癌的一个标志

　　

深度视觉蛋白质组学揭示印戒细胞癌的关键特征与潜在治疗策略

近期，哥本哈根大学诺和诺德基金会蛋白质研究中心的研究人员在npj Precision Oncology期刊上发表了一篇题为 “Deep visual proteomics reveals DNA replication stress as a hallmark of signet ring cell carcinoma” 的论文。该研究运用深度视觉蛋白质组学（DVP）技术，对印戒细胞癌（SRCC）进行了深入探究，为理解 SRCC 的发病机制、寻找潜在治疗靶点以及制定个性化治疗策略提供了重要依据，在精准肿瘤学领域具有关键意义。

一、研究背景

SRCC 是一种罕见且恶性程度高的腺癌，可发生于多个器官，胃是最常见的原发部位，但也有在前列腺、乳腺、肺和膀胱等器官发病的报道。近年来，胃癌中 SRCC 的发病率持续上升。由于其发病隐匿，患者确诊时往往已处于晚期，治疗选择有限，预后较差。目前针对 SRCC 的研究多集中于临床观察、组织学分类和基因组测序，对其基本生物学特性和潜在信号通路的了解存在较大差距，这限制了个性化治疗策略的制定。此前研究虽发现 SRCC 与 RAS/RAF/MAPK、HER2、Wnt/β - catenin 等信号通路异常，以及 E - cadherin 基因 CDH1 突变有关，但对其整体分子机制的认识仍不全面。因此，从蛋白质水平进行全局分子分析，有助于阐明 SRCC 更广泛的生物学背景和独特的致病机制。

二、研究材料与方法

（一）研究对象

研究选取了一名经磁共振成像（MRI）检查发现膀胱壁有可疑肿块，后被确诊为 SRCC 的患者。该患者接受了根治性膀胱切除术，切除了膀胱、前列腺、精囊和 14 个淋巴结。研究使用的组织均在治疗前获取。

（二）技术路线

1. 样本处理与染色：对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织块进行切片，厚度为 3μm，并将其固定在聚乙烯萘二甲酸酯（PEN）膜包被的显微镜载玻片上。用 4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）染色以显示细胞核，使用小麦胚芽凝集素（WGA）染色来勾勒细胞膜，相较于其他染色方法，WGA 染色在效率和简便性上表现更优。

2. 细胞分割与分类：利用生物图像分析软件（BIAS）对组织切片进行成像和图像处理。通过微调预训练模型进行细胞分割，并训练机器学习模型对细胞进行分类。该模型通过手动注释各器官的 1000 多个 SR 细胞和淋巴细胞来捕捉形态多样性，经 10 倍交叉验证和病理学家独立验证，SR 细胞的预测准确率达 95%。

3. 激光显微切割与质谱分析：将分类后的 SR 细胞形状导出，用于半自动激光显微切割。每个样本从 FFPE 组织中激光显微切割 500 个细胞形状（约相当于 50 个完整大小的 SR 细胞），每个器官收集 1500 个细胞形状（分三次收集，每次 500 个），进行裂解和酶消化，随后通过液相色谱 - 质谱（LC - MS）进行蛋白质组学分析。肽段通过 Evosep One 色谱系统分离，并与 Orbitrap Astral?质谱仪联用，使用 DIA - NN 软件进行蛋白质鉴定和定量。

4. 生物信息学分析：将蛋白质组数据导入 Perseus 软件进行注释和缺失值插补，并进行统计检验和多重假设检验校正。使用 Python 和 GSEApy 包进行基因集富集分析（GSEA），利用多种 Python 库和 ShinyGo 网络工具进行数据可视化和基因本体（GO）术语富集分析。

三、研究结果

（一）患者疾病背景与干预措施

患者最初被诊断为 SRCC，膀胱为原发部位。术后病理显示多个器官及部分淋巴结存在 “纯印戒形态腺癌” 细胞。基因组分析发现微卫星不稳定性仅为 0.8%，存在 ATRX 移码突变、MYCL 和 RICTOR 扩增以及 KDM6A 双等位基因缺失。患者先后接受了多种化疗方案，但因副作用停药。化疗停止 12 个月后，淋巴结出现复发，随后接受了派姆单抗免疫治疗和卡铂化疗，卡铂化疗因副作用再次停药，目前派姆单抗免疫治疗仍在进行中。

（二）DVP 工作流程中的染色与细胞分析

WGA 染色能够实现对细胞的稳健分割和分类，满足 DVP 工作流程需求。通过对大量细胞的手动注释训练的机器学习模型，在细胞分类上表现出高准确性，为后续精确的蛋白质组学分析奠定了基础。

（三）蛋白质组分析确定器官特异性 SRCC 和 DDR 蛋白特征

1. 蛋白质定量与分析：对四个器官中相当于 50 个 SR 细胞的样本进行质谱分析，并以非癌性前列腺上皮细胞为对照，量化了中位数为 6638 种不同蛋白质，数据集完整性高。主成分分析（PCA）显示，样本按组织来源聚类，癌性 SR 细胞与对照细胞明显分离，不同器官的 SR 细胞也存在差异。

2. 特异性蛋白标记物：确定了不同器官 SR 细胞的特异性蛋白，如精囊中负责精子凝胶基质形成的 SEMG2。同时发现，与上皮对照细胞相比，SR 细胞中 CEACAM5、CEACAM6、MUC2、MUC5B 等经典 SRCC 标记物显著富集。在前列腺中，SR 细胞的 MUC 和 CEACAM 蛋白明显富集，但与传统前列腺癌相关的蛋白差异较小，表明其具有独特的蛋白质组。

3. GO 富集分析：对前列腺 SR 细胞中高度富集的蛋白质进行 GO 富集分析，发现主要富集在 DNA 复制和 DNA 损伤反应（DDR）相关途径，包括核苷酸切除修复、碱基切除修复和错配修复等，且 MMR 途径在所有 SR 阳性组织中均有富集。

（四）印戒细胞在多个器官中表现出 DDR 途径缺陷

1. 组织特异性蛋白变化：通过比较不同组织间蛋白质的变化倍数，发现 LYPD8、UGT2B17、S100P、MUC2 和 CLCA1 等蛋白在不同组织中表达模式相似。对 1560 个 ANOVA 显著蛋白质进行无监督层次聚类，发现 SR 细胞中存在与对照细胞不同的蛋白质表达模式，主要涉及 Wnt、EGF 受体、TGF - β 受体等信号通路以及 DNA 复制和 DDR 途径。

2. GSEA 分析：基因集富集分析（GSEA）显示，SR 细胞与上皮对照细胞相比，DDR 相关途径显著富集，包括复制前复合物激活、ATR 激活等。对 pATR 进行染色，证实了 ATR 信号通路在组织样本中的激活，其中精囊组织中阳性率最高。

3. DNA 修复相关蛋白变化：在 SR 细胞中，参与复制叉保护和复杂 DNA 损伤修复的蛋白，如 FANCD2、FANCI、RECQL5、WRN 和 HLTF 等均呈现正倍数变化，表明细胞在应对复制应激时上调了相关保护机制。同时，易错的断裂诱导复制（BIR）途径在 SR 细胞中也显著富集，相关的 DNA 聚合酶亚基 POLD3、POLD2 和 POLE 也呈现正倍数变化。此外，APOBEC3 家族酶在 SR 细胞中丰度显著降低，可能是一种维持基因组稳定性的保护机制。

（五）印戒细胞中补体系统和 PD - 1 信号蛋白的富集导致细胞毒性 T 淋巴细胞浸润

1. 免疫相关蛋白变化：Reactome 途径分析显示，补体系统和 PD - 1 信号通路相关蛋白在 SR 细胞中呈现正倍数变化，尤其是 C1QA、C1QB、C1QC 以及免疫球蛋白相关蛋白。

2. 免疫细胞浸润与蛋白表达：对膀胱组织（原发肿瘤部位）和淋巴结（转移部位）进行免疫染色，发现 PD - 1 阳性 T 细胞有中度至大量浸润，膀胱 SR 细胞上的 PD - L1 表达也明显上调。这表明免疫疗法，特别是 PD - 1/PD - L1 抑制剂，可能是治疗 SRCC 的有前景的方法。患者接受派姆单抗免疫治疗后，肿瘤进展得到有效控制。

四、研究结论与讨论

（一）研究结论

1. 该研究利用 DVP 技术，在单细胞水平对 SRCC 进行蛋白质组学分析，揭示了 SRCC 的蛋白质组景观，确定了其共同和器官特异性的蛋白质模式。MUC1、MUC2、MUC13 等粘蛋白以及 CEACAM5、CEACAM6 在 SR 细胞中显著富集，对 SRCC 的独特形态和侵袭性行为具有重要作用。

2. 研究发现 SRCC 中存在 DDR 途径的显著改变，包括 MMR、BER 和 NER 等机制的变化，以及 ATR 信号轴的上调，表明复制应激是 SRCC 的关键特征。复制应激导致复制叉停滞和崩溃，细胞通过激活 BIR 等易错修复途径应对，这与 SRCC 的高突变率和基因组不稳定相关。

3. SRCC 的 DDR 途径改变与免疫相关蛋白特征的富集有关，补体系统和 PD - 1 信号通路相关蛋白的变化导致细胞毒性 T 淋巴细胞浸润，为免疫疗法在 SRCC 治疗中的有效性提供了理论依据。派姆单抗免疫治疗对该患者的成功应用，也证实了蛋白质组分析在指导治疗决策中的潜在价值。

（二）讨论

1. 研究意义：本研究首次全面地从蛋白质组层面解析了 SRCC，为理解其肿瘤发生特性和潜在信号通路提供了新视角。研究结果为 SRCC 的治疗提供了潜在靶点，如针对 ATR 途径或利用 DNA 修复机制的脆弱性开发靶向疗法，同时 CEACAMs 的过表达也为抗体 - 药物偶联物等靶向治疗提供了可能。此外，研究还强调了蛋白质组分析在指导治疗决策中的重要性，尤其是在基因组数据不足以完全反映肿瘤生物学特性的情况下。

2. 研究局限性与展望：本研究仅基于一名患者，其结果的普遍性有待进一步验证。未来需要开展更大规模、涉及不同队列的研究来确认这些发现，并探索该方法在诊断和治疗方面的潜力。同时，针对 DNA 修复途径中受损蛋白的功能分析，以及将蛋白质组数据与基因组和转录组数据整合，有望更全面地理解 SRCC 的生物学机制，为开发更有效的诊断和治疗策略提供支持。

综上所述，该研究通过深度视觉蛋白质组学技术，对印戒细胞癌进行了深入剖析，为精准肿瘤学的发展做出了重要贡献，其研究成果为后续的临床研究和治疗实践提供了极具价值的参考。