果蝇 USP14 调控生物钟蛋白 PER 稳定性的关键机制探秘

为探究泛素特异性肽酶 14（USP14）对果蝇生物钟蛋白 PER 稳定性及昼夜节律的影响，研究人员开展相关研究。结果发现 USP14 通过调节泛素连接酶 SLIMB 间接调控 PER 稳定性，特定泛素化位点对维持昼夜节律至关重要。该研究揭示了生物钟调控新机制。

　　在奇妙的生命世界里，昼夜节律如同一个精准的 “体内时钟”，掌控着生物体的行为和生理活动，其周期约为 24 小时，从人类的作息规律到昆虫的活动节奏，都受其影响。在果蝇体内，昼夜节律的调节依赖于生物钟蛋白的振荡，其中 PERIOD（PER）蛋白起着关键作用 。PER 蛋白水平的波动决定了昼夜节律的周期和相位，它的周转受到翻译后修饰的严格调控，包括磷酸化、泛素化等过程。

然而，目前关于果蝇中 PER 蛋白被 SLIMB 降解的确切机制仍不明确。同时，在哺乳动物中，虽然已知泛素特异性肽酶 14（USP14）和 β -TRCP 在调节 mPER 蛋白稳定性中发挥作用，但果蝇中 USP14 对 PER 蛋白稳定性的影响及作用机制尚不清楚。为了解开这些谜团，来自韩国多个研究机构（包括 Ajou University Graduate School of Medicine、University of Ulsan College of Medicine 等）的研究人员开展了深入研究。

该研究成果发表在《Communications Biology》上，研究表明果蝇 USP14 通过稳定泛素连接酶 SLIMB 间接调节 PER 蛋白稳定性，并且发现 PER 蛋白上的 K1117 和 K1118 残基是关键的泛素化位点，对维持昼夜节律至关重要。这一发现为理解昼夜节律的调控机制提供了新的视角，有助于进一步探究生物钟相关疾病的发病机制和潜在治疗靶点。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：

1. 果蝇遗传学技术：利用 Gal4/UAS 系统，在果蝇时钟细胞中过表达或敲低 USP14，构建不同基因型的果蝇品系。
2. 蛋白质分析技术：通过免疫印迹（immunoblotting）检测蛋白水平变化；运用免疫沉淀（immunoprecipitation）结合质谱分析（mass spectrometry）鉴定 PER 蛋白的泛素化位点。
3. 细胞生物学技术：培养果蝇 S2 细胞，进行转染实验，敲低相关基因，研究蛋白稳定性和相互作用。
4. 行为学分析技术：使用果蝇活动监测系统（Drosophila Activity Monitoring System）分析果蝇的昼夜运动行为节律。

下面来详细看看研究结果：

1. USP14 过表达降低 PER 水平：研究人员利用 tim (UAS)-gal4 驱动子在时钟细胞中过表达 USP14。实验结果显示，与对照组相比，过表达 USP14 的果蝇中 PER 蛋白水平全天都显著降低，但 TIM 蛋白水平不受影响。进一步检测发现，USP14 过表达不影响 per 和 tim 基因的 mRNA 水平，这表明 USP14 主要在翻译后水平影响 PER 稳定性。在昼夜运动行为分析中，USP14 过表达虽使果蝇昼夜周期略有缩短，但对昼夜节律性无明显影响。通过检测起搏器神经元（sLN_vs）中的 PER 蛋白水平，发现虽然过表达 USP14 的果蝇 sLN_vs 中 PER 水平在 CT28 时略有降低，但其余时间与对照组相当，这解释了为何整体 PER 水平下降但昼夜节律未受显著影响。对视网膜进行免疫染色发现，过表达 USP14 的果蝇视网膜中 PER 强度明显降低，说明全头提取物中 PER 水平的显著降低主要源于视网膜的变化。
2. USP14 敲低增加 PER 水平：研究人员敲低时钟细胞中的 USP14，结果显示，与对照组相比，USP14 敲低（KD）果蝇的 PER 水平略有升高，这与过表达 USP14 的结果相反，且通过定量实时 RT - PCR 验证了 Usp14 mRNA 的有效敲低。在昼夜运动行为分析中，USP14 敲低对果蝇昼夜周期和节律性也无显著影响。在持续黑暗（DD）条件下检测 sLN_vs 中的 PER 水平，发现 USP14 KD 果蝇的 sLN_vs 中 PER 水平在大部分时间都略高于对照组，但由于升高幅度较小，所以对昼夜行为影响不明显。这一系列实验表明，USP14 参与了 PER 稳定性的调节。
3. USP14 调节 SLIMB 的稳定性：鉴于 USP14 过表达和敲低对 PER 水平的相反影响，研究人员推测 USP14 可能通过调节特定蛋白来影响 PER 稳定性，于是聚焦于 SLIMB。在果蝇 S2 细胞中，研究人员发现随着 USP14 水平升高，SLIMB 蛋白水平也增加，且 USP14 过表达延迟了 SLIMB 的降解速率。通过共免疫沉淀实验证实了 USP14 与 SLIMB 存在物理相互作用，同时发现 USP14 过表达减少了泛素介导的 SLIMB 蛋白降解。为模拟动物生物钟，研究人员诱导 dbt - V5 表达使 PER 磷酸化，结果显示在敲低 slimb 基因的 S2 细胞中，USP14 对野生型 PER 蛋白稳定性的影响几乎消失，这表明 USP14 通过增强 SLIMB 的稳定性来加速 PER 蛋白的降解。
4. PER 蛋白泛素化位点的鉴定及其意义：为深入了解 USP14 驱动 PER 蛋白降解的分子机制，研究人员进行质谱分析，鉴定出 PER 蛋白上的三个潜在泛素化残基 K53、K1117 和 K1118。通过构建多种 PER 突变体进行实验，发现将 K1117 和 K1118 突变为丙氨酸（Ala）的双突变体 PER^{K1117A,K1118A}对蛋白降解具有抗性。进一步实验表明，增加 SLIMB 的表达对 PER^{K1117A,K1118A}突变体水平影响不大，但显著降低了野生型 PER 的水平。同时，USP14 对 PER^{K1117A,K1118A}突变体蛋白稳定性的影响消失，这表明 K1117 和 K1118 残基是泛素结合的潜在靶点。在 per - null 背景下表达野生型 PER（PER^WT）和 PER^{K1117A,K1118A}突变体，结果显示 PER^WT蛋白水平呈现明显的节律性积累和降解，而 PER^{K1117A,K1118A}突变体则没有明显的节律性，且该突变体无法有效恢复 per⁰¹果蝇的节律性和节律强度。这些结果突出了 K1117 和 K1118 残基在调节 PER 蛋白稳定性和维持昼夜节律中的关键作用。

综上所述，研究结论表明果蝇 USP14 通过稳定 SLIMB 来调节 PER 蛋白的降解，PER 蛋白上的 K1117 和 K1118 残基对其稳定性和昼夜节律的维持至关重要。在讨论部分，研究人员指出，虽然 USP14 对 PER 蛋白水平的调节在全头提取物中表现明显，但对昼夜节律的影响较小，可能是因为其对 sLN_vs 中 PER 水平影响有限。同时，与哺乳动物中 USP14 对 mPER 蛋白的作用不同，果蝇 USP14 通过间接方式调节 PER 稳定性，这可能反映了不同物种在进化过程中对 PER 降解调控方式的差异。该研究不仅揭示了果蝇中昼夜节律调控的新机制，也为进一步研究生物钟相关疾病提供了重要线索，为理解生命体内复杂的生物钟调控网络奠定了基础。