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为解决 SpCas9 在基因组编辑中存在的效率低、脱靶效应等问题，研究人员开展对 SpCas9 直系同源物的研究。筛选出 10 种有活性的同源物，发现 SeqCas9 识别 NNG PAM，活性和特异性与 SpCas9-HF1 相当，碱基编辑效率更优，为基因组编辑提供新工具。
在生命科学的前沿领域，基因组编辑技术一直是研究的热点。其中，SpCas9 作为最早应用于基因组编辑的 Cas9 核酸酶，曾经为科研工作者们打开了新世界的大门。它就像一把神奇的 “基因剪刀”，能对 DNA 进行精准地切割和修改。然而，随着研究的深入，人们发现这把 “剪刀” 并非完美无缺。在某些基因位点上，SpCas9 的编辑效率较低，就像是一把钝了的剪刀，剪不断基因的 “链条”；而且它还存在严重的脱靶效应，就像射箭时偏离了目标靶心，这可能会导致意想不到的基因变化，引发各种潜在风险。此外，它对 PAM（protospacer adjacent motif，原间隔序列邻近基序）序列有着严格的要求，只能识别特定的 NGG PAM，这大大限制了它的应用范围。在碱基编辑方面，SpCas9 也存在效率不高的问题，难以满足科研和临床应用的需求。
为了解决这些难题，来自复旦大学附属浦东医院、中国林业科学研究院等机构的研究人员决定踏上探索之旅，开展了一项关于 SpCas9 直系同源物的研究。他们希望能找到新的 “基因剪刀”，突破 SpCas9 的局限。
研究人员首先在 NCBI 的基因数据库中寻找 SpCas9 的相关直系同源物，经过层层筛选，最终挑选出 18 种进行深入研究。这些同源物的氨基酸序列与 SpCas9 的相似度在 30.98% - 86.03% 之间。随后，研究人员利用 GFP 激活试验来检测这些同源物的基因组编辑能力。他们将一段带有随机序列的目标序列插入到 GFP 编码序列中，当 Cas9 核酸酶对目标序列进行编辑时，会产生插入或缺失突变（indels），从而恢复 GFP 的表达，这样就能通过观察 GFP 的表达情况来判断 Cas9 的活性。通过这个试验，研究人员发现有 10 种同源物在人类细胞中表现出了活性，而且这些同源物大多偏好富含嘌呤的 PAM 序列。
在这 10 种有活性的同源物中，SeqCas9 脱颖而出。研究人员进一步对 SeqCas9 的活性进行了深入研究。他们设计了不同长度的间隔序列（spacer），发现 20 - nt 的间隔序列在某些位点能使 SeqCas9 展现出较高的活性。在与 SpCas9、SpCas9-HF1 等的活性比较中，SeqCas9 在多个内源性位点上表现出了不错的活性。例如，在一些含有 NAG、NCG 和 NTG PAM 的位点上，SeqCas9 的编辑效率超过了 SpCas9 和 SpCas9-NG。
研究人员还对 SeqCas9 的特异性进行了评估。他们设计了带有单核苷酸错配的 sgRNA，转染细胞后通过深度测序来检测脱靶效应。结果显示，SeqCas9 对多个位点的单核苷酸错配较为敏感，整体特异性较高。通过基因组范围的无偏识别双链断裂测序（GUIDE-seq）技术，研究人员发现 SeqCas9 在编辑特定基因位点时，诱导的脱靶位点数量极少，与高保真版本的 SpCas9-HF1 相当，展现出了优秀的特异性。
碱基编辑是基因组编辑的重要应用领域，研究人员也对 SeqCas9 在这方面的潜力进行了挖掘。他们通过引入 D10A 突变，将 SeqCas9 转化为 SeqCas9n（nickase，切口酶），并分别构建了基于 SeqCas9n 的腺嘌呤碱基编辑器（SeqABE）和胞嘧啶碱基编辑器（SeqCBE）。在对多个内源性位点的碱基编辑实验中，SeqABE 和 SeqCBE 表现出色。以 SeqABE 为例，在编辑含有 NAG、NCG 和 NTG PAM 的位点时，它实现了多个腺嘌呤（A）到鸟嘌呤（G）的转换，编辑效率优于基于 SpCas9-NRRH 和 SpCas9-NG 的碱基编辑器。同样，SeqCBE 在对胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的转换编辑中，也展现出了较高的效率。研究人员还利用 SeqABE 对 PCSK9 基因的剪接供体和受体进行编辑，发现 SeqABE 在部分位点的编辑效果优于 ABEmax-NG，这为心血管疾病相关研究提供了新的潜在工具。此外，研究人员尝试使用脂质纳米颗粒（LNP）来递送 SeqCas9 mRNA 和 sgRNA，结果表明 LNP 能够成功将其递送至 HEK293T 细胞并实现基因组编辑，编辑效率在不同位点有所差异，最高可达 59.9% 。
这项研究意义重大。从基础研究角度来看，它拓展了人们对 SpCas9 直系同源物的认识，揭示了 PAM 序列的多样性，让科研人员对 Cas9 家族有了更深入的理解。在应用层面，SeqCas9 为基因组编辑提供了一种新的高效工具。它在碱基编辑方面的优势，使得科研人员在进行基因治疗、疾病模型构建等研究时，有了更精准、更高效的选择，有望推动生命科学和医学领域的进一步发展。
研究人员在开展这项研究时，主要用到了以下关键技术方法：一是利用 GFP 激活试验筛选有活性的 SpCas9 直系同源物并鉴定其 PAM 序列；二是通过深度测序技术检测基因编辑后的 indels 效率、评估特异性以及分析碱基编辑效果；三是运用 GUIDE-seq 技术进行全基因组范围的脱靶效应检测；四是使用脂质纳米颗粒（LNP）递送技术，将 SeqCas9 mRNA 和 sgRNA 递送至细胞内实现基因组编辑。研究样本主要使用 HEK293T 细胞系。
研究结果总结如下：
- SpCas9 直系同源物的筛选与 PAM 分析：筛选出 18 种 SpCas9 直系同源物，10 种在人类细胞中有活性，且多偏好富含嘌呤的 PAM 序列，如 SeqCas9 偏好 NRG（R = A 或 G）PAM，进一步聚焦研究 4 种识别二核苷酸 PAM 的同源物。
- 活性测试：设计特定 sgRNA，通过 GFP 激活试验对比不同 Cas9 同源物与各自及 SpCas9 的 sgRNA 支架的活性，发现使用匹配的 sgRNA 支架能提高活性，且支架不影响 PAM 识别。在多个内源性位点比较活性，得出活性排序为 SpCas9 > SpRY > SeqCas9 > SpCas9-HF1 > Slu1Cas9 > Slu2Cas9 。优化 SeqCas9 的间隔序列，确定 20 - nt 间隔序列在部分位点活性最佳。在不同 PAM 位点比较编辑效率，SeqCas9 在 NAG、NCG 和 NTG PAM 位点表现更优。
- 特异性测试：设计带单核苷酸错配的 sgRNA 转染细胞，深度测序评估特异性，SeqCas9 对多个位点错配敏感，整体特异性较高。利用 GUIDE-seq 技术检测，SeqCas9 在编辑特定位点时几乎无脱靶位点，与 SpCas9-HF1 相当。
- 碱基编辑研究：构建 SeqABE 和 SeqCBE，对多个内源性位点进行碱基编辑，SeqABE 在 A 到 G 转换、SeqCBE 在 C 到 T 转换上，编辑效率优于基于 SpCas9-NRRH 和 SpCas9-NG 的碱基编辑器。使用 SeqABE 编辑 PCSK9 基因的剪接位点，部分位点效果优于 ABEmax-NG。利用 LNP 递送 SeqCas9 mRNA 和 sgRNA，在不同位点实现了基因组编辑，最高编辑效率达 59.9% 。
研究结论与讨论部分强调，该研究发现了多种 SpCas9 直系同源物的 PAM 序列，丰富了对 Cas9 家族 PAM 多样性的认识。SeqCas9 作为一种能识别简单 NNG PAM 的 Cas9 变体，其活性和特异性与 SpCas9-HF1 相当，且在碱基编辑方面表现突出，编辑窗口窄，编辑效率高于 SpCas9-NG 和 SpCas9-NRRH 。这一研究成果为基因组编辑技术的发展提供了新的方向和有力工具，有望在基因治疗、疾病研究等多个领域发挥重要作用，推动生命科学和健康医学的进步。
