解析狼蛛毒素肽 Protoxin-I 抑制人 NaV1.8 的结构基础：为新型镇痛药研发点亮曙光

为解决 NaV1.8 作为镇痛药靶点，其选择性抑制剂作用机制不明的问题，研究人员开展人 NaV1.8 与 Protoxin-I 结合的结构研究。结果获得两者结构，揭示抑制机制。这为设计靶向 NaV1.8 的镇痛药提供关键依据。

　　

在人体的微观世界里，离子通道如同精密的分子机器，掌控着细胞的电活动。其中，电压门控钠通道（Voltage-gated sodium channels，Na_Vs）尤为关键，它能选择性地让钠离子穿过细胞膜，在可兴奋细胞中负责传播动作电位。人类有九种 Na_V亚型，它们虽然在序列上差异细微，但却各自承担着独特的生理功能。

Na_V1.8 作为其中一员，是三种对河豚毒素有抗性的 Na_V之一。它有着与众不同的 “个性”：激活和失活的电压依赖性相对去极化，失活动力学较慢，还有持续增强的电流。这些特性使它在动作电位上升阶段成为主要的内向电流 “推动者”，也在背根神经节（DRG）神经元的过度兴奋和重复放电中 “发挥作用”，并且它在低温环境下仍能坚守 “岗位”，维持自身的门控特性。

更重要的是，Na_V1.8 与疼痛紧密相连。一些患者因 Na_V1.8 功能获得性突变，导致 DRG 神经元兴奋性增加，进而引发周围神经病变疼痛；而功能丧失性突变的患者则痛感降低。此外，它还参与了炎症性疼痛的过程。就像沙漠蝗虫小鼠对亚利桑那树皮蝎毒液不敏感，就是因为其 Na_V1.8 通道发生了突变。这些发现让 Na_V1.8 成为镇痛药研发的热门靶点，而从动物毒液中提取的肽类物质作为 Na_V活动的调节剂，备受关注。

狼蛛毒液中的 Protoxin-I（ProTx-I）就是这样一种肽，它是门控修饰肽，能改变 Na_V1.8 的激活电压阈值，阻止通道开放。然而，此前它抑制 Na_V1.8 的结构基础一直是个谜。为了解开这个谜团，美国加利福尼亚大学欧文分校（University of California Irvine）的研究人员 Bryan Neumann、Stephen McCarthy 和 Shane Gonen 开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为理解 ProTx-I 的作用机制以及开发靶向 Na_V1.8 的镇痛药提供了重要线索。

研究人员采用了一系列先进的技术方法。他们利用哺乳动物 HEK293 细胞表达全长人 Na_V1.8，通过优化表达和纯化条件，结合单层石墨烯网格技术，提高了样本质量和数据收集效率。随后，运用单颗粒冷冻电镜（cryoEM）技术，分别获得了 apo-hNa_V1.8（无 ProTx-I 结合的人 Na_V1.8）和 hNa_V1.8-ProTx-I 复合物的高分辨率结构。

apo-hNa_V1.8 的结构

研究人员在 HEK293 细胞中共表达人 Na_V1.8 的 α 亚基和 β4 亚基，尽管 β4 亚基理论上有助于稳定蛋白、提高表达水平，但纯化后仅观察到 α 亚基。为提高 hNa_V1.8 产量，研究人员筛选了多个参数，并优化了从溶解到纯化的时间。在制备冷冻电镜样本时，他们尝试了多种网格类型，最终发现单层石墨烯网格效果最佳，仅用少量细胞培养物就能获得高质量的重构结构。

通过冷冻电镜，研究人员获得了分辨率为 3.1 ? 的 apo-hNa_V1.8 结构。该结构呈现出失活通道的特征，如电压敏感结构域（VSD）上的门控电荷残基呈 “向上” 构象，IFM 快速失活基序隐藏在其结合位点中。同时，他们还观察到多个 N - 连接糖基化位点以及可能的胆固醇、脂质和去污剂分子结合位点。但令人意外的是，VSD 的密度在二维和三维分类以及最终重构中几乎完全缺失。进一步分析发现，VSD 的 S4 - S5 连接子存在两种不同的重定位状态，这可能是导致 VSD 难以解析的原因，并且这种运动与通道的激活阈值变化有关。

ProTx-I 结合复合物的结构

制备 hNa_V1.8 - ProTx-I 复合物时，研究人员先将 ProTx-I 溶液与纯化的 apo-hNa_V1.8 孵育，再用高分子量截止滤器去除未结合的肽，最终获得了分辨率为 2.8 ? 的结构。在该结构中，除 ProTx-I 结合区域外，hNa_V1.8 的结构与 apo-hNa_V1.8 相似，但 VSD 和细胞外环有轻微的刚性位移和小的运动。

ProTx-I 的密度在结构中清晰可见，它结合在 VSD_II的 S3 - S4 连接子上，部分嵌入洗涤剂胶束（模拟细胞膜脂质双层）中，通过一组芳香族和脂肪族残基形成的 “疏水补丁” 与膜相互作用。结合 ProTx-I 后，VSD_II的 S3 - S4 连接子发生向内移动，导致其部分重新定位在 S4_II螺旋顶部，阻碍了 S4_II螺旋在激活过程中的移动，这就解释了 ProTx-I 作为门控修饰肽的作用机制。

研究人员还发现，ProTx-I 与 hNa_V1.8 的结合存在一些有趣的现象。虽然之前的诱变实验表明 ProTx-I 也能结合 hNa_V1.7 的 VSD_IV，但在 hNa_V1.8 - ProTx-I 结构中，并未观察到 ProTx-I 在 VSD_IV上方的密度，这可能与 hNa_V1.7 和 hNa_V1.8 中 VSD_IV的 S1 - S2 和 S3 - S4 连接子区域序列差异有关。

研究结论与讨论

这项研究成功解析了 apo-hNa_V1.8 和 hNa_V1.8 - ProTx-I 复合物的冷冻电镜结构，揭示了 ProTx-I 抑制 Na_V1.8 的结构基础。ProTx-I 通过与 VSD_II的 S3 - S4 连接子结合，改变其构象，阻碍 S4_II螺旋的移动，从而抑制通道激活。

研究中使用的单层石墨烯网格技术为未来研究其他 hNa_Vs 和类似复杂蛋白质的结构提供了有效的方法。这些结果对于开发靶向 hNa_V1.8 的镇痛药具有重要意义，有助于设计出更高效、更具选择性的药物，为疼痛患者带来新的希望。同时，研究还发现了 Na_V1.8 中 VSD 的独特运动模式，为进一步理解电压门控钠通道的功能和调节机制提供了新的视角。

总的来说，这项研究在离子通道结构与功能、镇痛药研发等领域取得了重要突破，为后续研究奠定了坚实基础，有望推动相关领域的进一步发展。