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为解决研究神经元长期结构 - 功能关系时传统刺激方法的局限问题，研究人员开展了光遗传刺激齿状颗粒细胞（GCs）的研究。结果发现该刺激可减轻去神经支配诱导的 GCs 结构损伤，为体外研究神经回路活动和重塑提供了新方法。
在神经科学的研究领域中，理解神经元的长期结构 - 功能关系一直是科学家们努力攻克的难题。传统的研究方法，如使用刺激和记录电极，存在诸多限制，不仅需要与组织进行物理接触，而且实验后为避免组织污染，培养物往往会被固定或丢弃，难以对神经元进行长期、动态的观察和研究。在这样的背景下，寻找一种更先进、更有效的研究手段迫在眉睫。
来自德国歌德大学医学院的研究人员，针对这一困境展开了深入研究。他们以器官型切片培养（Organotypic slice cultures，OTCs）为研究模型，聚焦于海马体中的齿状颗粒细胞（dentate granule cells，GCs），运用光遗传技术，探索其对神经元结构和功能的影响。该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为神经科学领域带来了新的突破。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先是病毒载体转导技术，通过局部注射腺相关病毒（AAV）载体，将编码通道视紫红质 - 2（Channelrhodopsin - 2，ChR2）的基因导入 GCs 中，使其能够对光刺激产生响应。其次，运用全细胞膜片钳记录技术，精确测量细胞的电生理特性，验证 ChR2 表达对 GCs 基本电生理参数的影响，并确定激活 GCs 所需的光强度。此外，利用钙成像技术，借助基因编码的钙指示剂 jRCaMP1b，直观观察光刺激下 GCs 内的钙瞬变，进一步证实光遗传刺激对 GCs 的激活作用。
研究结果
- ChR2 - tdTomato 在 GCs 中的表达：将 AAV 载体注射到齿状回（DG）的颗粒细胞层（GCL）后，部分 GCs 表达 ChR2 - tdTomato。从注射后约 10 天开始表达，28 天后表达增强，且不同细胞表达水平存在差异。表达 ChR2 - tdTomato 的 GCs，其整个神经元结构包括细胞体、树突和轴突都能被标记，便于进行详细的结构分析12。
- 光遗传激活 GCs 的影响因素：通过全细胞膜片钳记录发现，ChR2 - 表达的 GCs 对光刺激的响应取决于光强度和细胞 ChR2 的表达水平。使用 450nm 和 505nm 波长的光刺激时，不同 GCs 对光强度的响应不同，部分 GCs 在较低光强度下就能产生动作电位（APs），而部分则需要更高光强度。且能被低光强度激活的 GCs，其 ChR2 表达水平相对较高345。
- 光刺激诱导 GCs 内钙瞬变：利用钙成像技术，研究人员发现约 90% 共表达 ChR2 和 jRCaMP1b 的 GCs 在光刺激下会产生钙瞬变，表明 APs 的发放。这一结果与膜片钳数据一致，进一步证实了神经元的兴奋性与 ChR2 表达水平相关6。
- 抗氧化剂对光毒性损伤的保护作用：长时间高强度光刺激会对 OTCs 造成光毒性损伤，使神经元受损。研究表明，450nm 光比 505nm 光的损伤更明显。然而，在培养基中添加抗氧化剂（AO），如谷胱甘肽、过氧化氢酶等，可显著减少光刺激导致的细胞死亡，保护 OTCs 免受光毒性损伤78。
- 光激活对去神经支配 GCs 树突棘损失的影响：切断内嗅皮层与 GCs 的连接（去神经支配）后，GCs 会出现树突棘损失。研究发现，慢性低频光激活去神经支配的 GCs，能减轻树突棘损失。这表明直接光激活 GCs 可补偿去神经支配导致的兴奋性输入丧失，对神经元结构起到一定的保护作用910。
研究结论与讨论
该研究成功建立了在复杂的内嗅 - 海马 OTCs 中运用光遗传学直接激活小鼠 GCs 的方法。研究结果表明，光遗传刺激不仅能有效激活 GCs，还能减轻去神经支配诱导的 GCs 结构变化。这一成果意义重大，为神经科学研究提供了新的技术手段和理论依据。
局部注射 AAV 载体实现了对 GCs 的选择性转导，使得在同一培养物中可直接比较转导和未转导的 GCs，排除了网络效应的干扰。同时，明确了光激活 GCs 的关键因素，即光强度和 ChR2 表达水平，为后续优化光遗传刺激方案提供了指导。此外，发现抗氧化剂可预防光毒性损伤，为长期光刺激实验提供了有效的保护策略。最重要的是，证实了慢性光激活能减轻去神经支配导致的树突棘损失，为治疗神经损伤相关疾病提供了潜在的干预靶点和新的研究方向。
总的来说，这项研究为深入理解神经回路活动和重塑机制奠定了基础，有望推动神经科学领域在神经损伤修复、神经系统疾病治疗等方面的进一步发展。
