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在生物成像和功能研究中，生物大分子的亲和标记至关重要，但高特异性识别聚糖的亲和探针稀缺。研究人员开发基于突变细菌唾液酸酶的聚糖重组亲和结合剂（GRABs），其对唾液酸聚糖特异性高、亲和力强，可用于多种实验，为研究聚糖功能提供了有力工具。
在生命的微观世界里，细胞表面覆盖着一层神秘的 “糖衣”—— 聚糖，它可不是简单的装饰，而是在各种生理和病理过程中都扮演着关键角色。就像细胞的 “语言大师”，通过聚糖的分子识别，细胞之间得以顺畅交流，在免疫反应、癌症发生发展等诸多方面发挥着不可或缺的作用。然而，想要深入了解聚糖的奥秘，精确标记和分析它们是绕不开的难题。
以往常用的亲和标记工具，比如植物来源的凝集素，就像是不太靠谱的 “翻译官”，特异性和亲和力欠佳，难以准确地 “解读” 聚糖的信息。而针对聚糖的特异性抗体，生成难度极大，就像在迷雾中寻找宝藏，困难重重。一方面，聚糖序列和结构在脊椎动物中高度保守，导致其免疫原性低，难以刺激机体产生有效的抗体；另一方面，现有的聚糖抗体常常会 “认错人”，除了结合聚糖表位，还会与特定的多肽序列结合，从而产生偏差。因此，开发一种高效、特异的聚糖标记工具迫在眉睫。
为了解开聚糖的神秘面纱，北京大学的研究人员踏上了探索之旅。他们成功开发出基于突变细菌唾液酸酶的聚糖重组亲和结合剂（GRABs），这一成果发表在《Nature Communications》上，犹如在聚糖研究的黑暗中点亮了一盏明灯。
研究人员运用了多种关键技术方法。在构建 GRABs 时，他们对细菌唾液酸酶的关键催化残基进行定点突变，使酶失去催化活性但保留对唾液酸聚糖的特异性结合能力。通过基因工程技术，将突变后的基因在大肠杆菌中表达并纯化出相应的蛋白。利用 CRISPR/Cas9 系统敲除细胞中的 N - 乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶（CMAS）基因，构建唾液酸聚糖缺陷型细胞，以此作为严格的阴性对照来验证 GRABs 的特异性。还运用等温滴定量热法（ITC）、聚糖微阵列分析、流式细胞术、免疫印迹、免疫沉淀和荧光成像等技术，对 GRABs 的结合特性、底物特异性以及在细胞和组织中的应用效果进行全面深入的研究。
泛特异性唾液酸聚糖结合的 GRAB
研究人员以肺炎链球菌神经氨酸酶 A（SpNanA）为基础，对其关键催化残基进行突变。SpNanA 原本可以水解各种唾液酸聚糖末端的唾液酸，但突变后的 SpNanAD372N和 SpNanAD372A失去了水解能力，却保留了与细胞表面唾液酸聚糖的结合能力。通过流式细胞术、蛋白质印迹和亲和捕获实验等研究发现，SpNanAD372N能够特异性地结合唾液酸糖蛋白和唾液酸聚糖，且对不同糖苷键连接的唾液酸聚糖，如 α2,3 - 和 α2,6 - 唾液酸糖苷，都有结合能力，这表明它可以作为一种泛特异性唾液酸聚糖标记的 GRAB（GRAB - Sia）。
α2,3 - 唾液酸糖苷结合的 GRAB
研究人员对属于糖苷水解酶家族 33（GH33）的 α2,3 - 唾液酸酶 Ruminococcus gnavus 神经氨酸酶 H（RgNanH）进行改造。将 RgNanH 的 D282 位点突变后，得到的 RgNanHD282A失去了唾液酸酶活性，但能特异性地结合含有 α2,3 - 唾液酸糖苷的唾液酸糖蛋白，可能是通过识别 α2,3 - 唾液酸聚糖来实现的，这一突变体被命名为 GRAB - Sia3。与常用的识别唾液酸聚糖的凝集素（如 SNA 和 MAL - II）以及商业的 SiaFindTM Lectenz 相比，GRABs 在唾液酸聚糖缺陷型细胞（CMAS-/- HEK293T 细胞）中表现出极低的非特异性结合，展现出了极高的特异性。
GRABs 的四聚化和底物特异性
通过等温滴定量热法（ITC）分析发现，GRAB - Sia 对 α2,3 - 唾液酸乳糖（3′SL）和 α2,6 - 唾液酸乳糖（6′SL）具有相似的亲和力，解离常数（Kd）分别为 17.8 μM 和 19.1 μM；GRAB - Sia3 与 3′SL 的 Kd为 7.15 μM，但不与 6′SL 结合。为了增强 GRABs 的亲和力，研究人员将其与链霉亲和素组装形成四聚体（tetra - GRABs）。利用聚糖微阵列分析发现，tetra - GRAB - Sia 对各类唾液酸聚糖都有较高的亲和力，除了那些在半乳糖残基上有分支的唾液酸聚糖；tetra - GRAB - Sia3 则对 α2,3 - 唾液酸聚糖表现出显著的偏好，几乎不识别 α2,6 - 和 α2,8 - 唾液酸聚糖。此外，tetra - GRABs 对含有 Neu5Ac 的唾液酸聚糖具有结合偏好，且能识别多种糖缀合物中的唾液酸化糖基序。
四聚体 GRABs 的亲和力增强
实验表明，与单体 GRABs 相比，tetra - GRABs 标记 HeLa 细胞的荧光强度显著增加，tetra - GRAB - Sia - AF647 和 tetra - GRAB - Sia3 - AF647 分别使荧光强度提高了 93 倍和 225 倍。tetra - GRABs 在低浓度（1 μg/mL）下就能达到较高的信噪比，且标记在 10 分钟内即可达到平衡，具有快速的结合动力学。同时，tetra - GRABs 在活细胞中具有良好的生物相容性，不会对细胞的增殖和存活产生明显影响，还可用于同时和多重分析同一样本中的总唾液酸聚糖和 α2,3 - 连接的唾液酸聚糖。
用四聚体 GRABs 对细胞中的唾液酸聚糖进行成像
在细胞成像实验中，用 tetra - GRAB - Sia - AF647、tetra - GRAB - Sia3 - AF488 和 SNA - Cy3 对固定的 HEK293T 细胞进行染色，结果显示，野生型细胞的质膜上能观察到代表总唾液酸聚糖、α2,3 - 连接的唾液酸聚糖和 α2,6 - 连接的唾液酸聚糖的强荧光信号，而在 SpNanA 处理或 CMAS 敲除的细胞中则没有这些信号，再次证实了 tetra - GRABs 的连接特异性。对固定并透化的 HeLa 细胞用 tetra - GRAB - Sia - AF647 染色后，发现 AF647 信号与高尔基体共定位，表明 tetra - GRABs 可用于成像细胞内的唾液酸聚糖。
用四聚体 GRABs 对组织中的唾液酸聚糖进行成像
在组织成像实验中，对小鼠的心脏、肾脏和肺组织切片用 tetra - GRAB - Sia - AF647 和 tetra - GRAB - Sia3 - AF488 染色后进行共聚焦荧光显微镜分析。结果显示，tetra - GRABs 在心脏和肾脏组织中均有强烈的标记，且在肾小球、肾小管上皮细胞等部位呈现出不同的唾液酸聚糖分布模式。与凝集素相比，tetra - GRABs 在组织染色中表现出更高的特异性。在肺组织中，tetra - GRAB - Sia3 的信号与上皮标记物 EpCAM 共定位，表明肺泡细胞中富含 α2,3 - 唾液酸聚糖。
用四聚体 GRABs 分析小鼠肠道中的唾液酸聚糖分布
研究人员对小鼠肠道切片进行染色，发现小肠中上皮细胞的唾液酸化水平较低，而大肠中唾液酸聚糖分布更为多样。在大肠的不同区域，总唾液酸聚糖和 α2,3 - 连接的唾液酸聚糖呈现出不同的分布模式。通过分析 RNA - seq 数据集发现，远端结肠中参与唾液酸生物合成和 α2,3 - 唾液酸转移酶的基因表达上调，这与 GRAB 染色结果相符。
研究人员开发的 GRABs 为唾液酸聚糖的标记和分析提供了一种强大而通用的工具。它具有高特异性、高亲和力、易于使用和生产等优点，克服了传统凝集素和抗体的诸多不足。GRABs 不仅可以用于研究哺乳动物细胞和组织中的唾液酸聚糖，未来还有望拓展到其他物种的糖基化研究。此外，通过进一步开发针对不同唾液酸聚糖亚型的 GRABs，结合其他蛋白质和脂质结合剂，能够更深入地研究特定的唾液酸糖缀合物，为聚糖功能的研究开辟新的道路，在生物医学领域具有广阔的应用前景。
