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推荐阅读！本文研究 150 例一氧化碳（CO）中毒患者及小鼠模型发现，CO 中毒引发炎症反应，血浆凝溶胶蛋白（pGSN）水平下降。注入重组人 pGSN 可缓解相关症状，表明 CO 诱导的认知缺陷或可通过药物干预逆转，为临床治疗提供新思路。
### 引言
一氧化碳（CO）是全球常见毒物，每年每百万人中约 137 人受其影响，在一些发展中国家发病率更高。美国虽无主动监测项目，但据急诊就诊数据估算，每年约有 5593 人因无意 CO 中毒就医。CO 中毒致死常发生在就医前，约 25 - 50% 的重度中毒幸存者会出现并发症，CO 诱导的神经后遗症每年治疗费用和收入损失超 10 亿美元。目前 CO 中毒无解药，常压和高压氧是仅有的干预手段，但美国仅约 6% 的医院有高压氧舱，可用性有限。
CO 中毒后数天至数周出现的神经功能缺损病因不明，其风险与血中碳氧血红蛋白（COHb）水平评估的缺氧应激相关性差。患者会出现脱髓鞘和脑白质改变，脑脊液中髓鞘碱性蛋白（MBP）升高。中性粒细胞活化在急性 CO 中毒患者中发生，在动物模型中，中性粒细胞活化会导致脑血管氧化应激，引发免疫反应和神经功能缺损。近期研究表明，CO 诱导小胶质细胞和星形胶质细胞活化可启动神经病理学进程，中枢神经系统（CNS）产生的炎症微粒（MPs）会激活中性粒细胞，引发全身炎症，扰乱血脑屏障（BBB），维持神经炎症循环。
在小鼠 CO 中毒模型中，发现与减压病（DCS）模型的脑 - 血 MPs 介导的炎症级联相似。重组人血浆凝溶胶蛋白（rhu - pGSN）在 DCS 模型中可减轻血管损伤，而在 CO 中毒相关机制中，血中表达丝状肌动蛋白（F - actin）的 MPs 会消耗 pGSN，导致其血浆水平下降。基于此，研究人员探究 CO 中毒患者是否存在 pGSN 水平降低和 F - actin 表达的 MPs，并在小鼠 CO 中毒模型中研究 F - actin MPs 的作用及注入 rhu - pGSN 的益处。
结果
- CO 中毒相关临床参数：研究人员评估了 2015 年 11 月至 2023 年 8 月在巴尔的摩马里兰大学医学中心和韩国原州延世基督教医院急诊科就诊的 150 例急性 CO 中毒患者。采集患者血液样本检测 MPs、中性粒细胞活化和 pGSN 水平，并与 150 例年龄和性别匹配的健康对照组比较。结果显示，CO 中毒患者存在炎症性 MPs、中性粒细胞活化，pGSN 水平下降约 90%。
通过全球恶化量表（GDS）评估患者 1 个月后的神经和认知结局，98 例患者完成随访。结果表明，患者年龄、血清肌钙蛋白水平和气管插管需求在 GDS 评分 1 分和大于 1 分的患者间存在显著差异，而意识丧失（LOC）病史对神经后遗症发生风险无显著影响。CO 中毒患者的实验室值在性别、种族方面无显著差异，与 GDS 评分大于 1 也无关联。韩国和美国患者的测量参数无显著差异，GDS 评分 2 - 3 分与 4 - 7 分患者间也无显著差异，CO 来源在恢复者和神经后遗症患者间也无显著差异。89% 的患者接受了高压氧（HBO?）治疗，估计 HBO?治疗延迟时间对患者结局无显著影响。
2. 小鼠 CO 暴露导致 MPs 升高和中性粒细胞活化：将小鼠暴露于 CO 1 小时后，发现其引流脑淋巴系统和血液的深颈淋巴结（DCLN）中 MPs 升高，且在 CO 暴露后 2 小时、2 周和 3 周时，MPs 水平相似。CO 暴露小鼠血液中 F - actin 表达的 MPs 显著高于对照组，且持续 3 周。检测 MPs 表面蛋白发现，中性粒细胞在 CO 反应中起作用，因为中性粒细胞减少的 CO 暴露小鼠 MPs 显著降低。通过流式细胞术检测发现，CO 暴露小鼠中性粒细胞活化（CD18 和髓过氧化物酶（MPO）表达增加）持续 3 周，而 CO 暴露对中性粒细胞上 pGSN 的影响不明显。
3. F - actin 阳性 MPs 触发血液和 DCLN 变化：给未接触过 CO 的小鼠静脉注射从 CO 暴露小鼠血液中分离的 60,000 个 F - actin MPs 或 F - actin 阴性 MPs，发现只有注射 F - actin MPs 会使受体小鼠血液和 DCLN 中的 MPs 升高，并导致中性粒细胞活化持续 3 周，而中性粒细胞减少的小鼠则不会出现这些变化。
4. pGSN 随 CO 暴露减少：CO 暴露小鼠在暴露后 2 小时、2 周和 3 周时，pGSN 水平显著降低。注射 CO 暴露小鼠的 F - actin MPs 也会导致 pGSN 降低，而注射不表达 F - actin 的 MPs 则不会。中性粒细胞减少的小鼠在暴露于 CO 或注射 F - actin MPs 时，pGSN 水平不会降低。
5. rhu - pGSN 消除 CO 和 F - actin MPs 诱导的变化：CO 暴露后立即注入 rhu - pGSN 可减轻 DCLN 和血液中 MPs 的升高以及中性粒细胞的活化。在 CO 暴露后 2 周内注入 rhu - pGSN，1 周后处死小鼠，发现 MPs 升高、中性粒细胞活化等现象消失。预先用 rhu - pGSN 处理 F - actin MP 悬液后再注射，不会导致 DCLN 或血液 MPs 升高、中性粒细胞活化或 pGSN 降低。向对照小鼠注射 rhu - pGSN 不会改变其 pGSN 水平。
6. 血管完整性干扰：给小鼠灌注罗丹明标记的赖氨酸固定化右旋糖酐（2×10? Da）评估血管损伤，发现 CO 暴露小鼠和注射 CO 暴露小鼠 F - actin MPs 的未接触过 CO 的小鼠，在 3 周内脑和骨骼肌血管存在渗出。CO 暴露后立即注入 rhu - pGSN 可防止血管渗漏，在 2 周时注射并在 1 周后处死小鼠也有类似效果。注射 F - actin 阴性 MPs 或中性粒细胞减少的小鼠注射 F - actin MPs、暴露于 CO 时，均未检测到血管渗漏。
7. CO 暴露后的神经炎症：通过蛋白质免疫印迹法检测富含内皮的脑匀浆评估炎症变化，发现 CO 暴露后 3 周，小鼠大脑中核因子 - κB（NF - κB）、磷酸化（p65）NF - κB、血小板反应蛋白 - 1（TSP）和 CD36 表达显著升高，水通道蛋白 - 4（AQP4）减少，中性粒细胞聚集（MPO 和 Ly6G 增加）。注射 F - actin MPs 的小鼠也有类似变化。CO 暴露后立即注入 rhu - pGSN 可防止炎症变化，2 周时注射并在 1 周后处死小鼠也有同样效果。CO 暴露的中性粒细胞减少小鼠和中性粒细胞减少的小鼠注射 F - actin MPs 未出现这些变化。
8. 小鼠 CO 暴露后的认知缺陷：执行功能障碍是 CO 中毒幸存者最常见的并发症之一，通过注意力转移和逆转任务评估小鼠认知功能。结果显示，CO 暴露小鼠在任务的前四个阶段与对照小鼠存在显著差异。修改预测刺激模式的任务中，CO 暴露组与对照组差异显著，表明 CO 暴露组在任务中采用了简单的解决问题策略。在 CO 暴露 2 周后注射 rhu - pGSN，发现 CO 暴露小鼠在重复的维度内转移（IDS）测试和 IDS 逆转测试中与对照小鼠无显著差异。注射 F - actin MPs 的小鼠比注射阴性 MPs 的小鼠表现更差。
9. 小鼠和人类 MPs 及中性粒细胞的体外研究：使用 CO 中毒患者样本评估 rhu - pGSN 对人 MPs 裂解的影响，发现 rhu - pGSN 对 F - actin 表达的颗粒裂解作用更明显。分析 CO 中毒患者和 CO 暴露小鼠中性粒细胞裂解物，发现其 NF - κB、p65 - 磷酸化 NF - κB、Src 激酶和磷酸化 Src 激酶含量增加，且中性粒细胞与 F - actin MPs 结合的三种受体（RAGE、CD36 和 TLR4）与一氧化氮合酶 - 1 适配蛋白（NOS1AP）的连接增加，其他相关蛋白也有不同程度增加。
讨论
CO 中毒患者表现出全身炎症反应，包括多种 MPs、中性粒细胞活化和 pGSN 显著降低。与恢复者相比，出现神经功能障碍的患者平均年龄大十岁，需要气管插管，且心脏损伤标志物肌钙蛋白升高，而 CO 中毒诱导的其他反应如格拉斯哥昏迷评分变化、意识丧失发生率和 COHb 水平等无显著差异。这表明心血管功能受损会增加神经功能障碍的风险，与动物模型结果一致。
研究结果表明，患者中观察到的炎症变化直接导致小鼠模型中神经功能障碍的发展。CO 中毒和 F - actin 表达的血液 MPs 会引发一系列变化，包括颈淋巴结和血液 MPs 升高、脑血管渗漏、血管周围中性粒细胞聚集、神经炎症以及脑内 AQP4 减少、CD36 升高。注入 rhu - pGSN 可阻止炎症过程，预防小鼠神经功能恶化。CO 暴露小鼠 pGSN 降低持续 2 周，此时注入 rhu - pGSN 仍可消除相关炎症变化和认知缺陷，说明 pGSN 降低在持续损伤中起作用，也表明神经功能缺陷可能是可逆的，但在人类中是否如此还需进一步研究。
F - actin MPs 可能是常见的炎症介质，在多种疾病中发挥作用。pGSN 具有多种抗炎作用，rhu - pGSN 治疗 CO 中毒的益处可能与其裂解 F - actin MPs 有关，而非直接对中性粒细胞的抗炎作用。本研究的局限性包括缺乏患者脱离污染环境后 pGSN 水平和 F - actin MPs 的信息，未来研究可关注其恢复和神经后遗症发生的关系，也可探索 rhu - pGSN 在临床治疗 CO 诱导神经后遗症中的应用。此外，约 35% 的患者失访，可能影响风险因素评估和神经并发症发生率的判断。
材料和方法
- 实验设计：先评估健康个体和 CO 中毒患者中 MPs 和中性粒细胞活化情况，再用已发表的小鼠 CO 中毒模型研究 F - actin MPs 在 CO 诱导炎症反应中的作用。
- 患者研究：所有操作符合赫尔辛基宣言，经机构审查委员会批准，获取患者知情同意后采集血液样本。急性 CO 中毒根据患者病史和升高的 COHb 水平诊断，患者在院前和急诊科接受 100% 氧气治疗，符合条件的尽快接受高压氧（HBO?）治疗。1 个月后用 GDS 评估患者神经和认知结局，血液样本收集后 3 - 10 天分析。
- 材料：化学试剂购自 Sigma - Aldrich，重组人凝溶胶蛋白由 BioAegis Therapeutics 提供。使用多种抗体和流式细胞术试剂，按制造商推荐浓度用于相应实验。
- 动物：使用 10 - 12 周龄的雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠，实验经马里兰大学机构动物护理和使用委员会批准。小鼠饲养在特定环境中，随机分组，实验数据盲法评分和分析，所有小鼠数据均纳入分析。
- 颈部淋巴结 MPs 获取和分析：按先前描述方法收集小鼠颈部淋巴结并处理，分离和分析 MPs。
- 血液 MPs 获取和处理：按先前方法分离和制备血液 MPs 用于流式细胞术分析，通过孵育和磁珠分离获得 F - actin 阳性 MPs。
- 中性粒细胞分离：按先前方法处理人和小鼠血液样本分离中性粒细胞，制备样本用于蛋白质免疫印迹法检测，进行 NOS1AP 免疫沉淀并量化蛋白条带密度。
- 用于再注射的 MPs：CO 暴露 2 小时后处死供体小鼠，分离血液 MPs 并按 F - actin 表达分选，计数和稀释后静脉注射给未接触过 CO 的小鼠。
- 认知测试：基于 Bissonette 和 Powell 的方法进行注意力转移和逆转测试，训练小鼠通过挖掘获取食物奖励，依次进行不同阶段测试，根据小鼠表现确定测试天数，判断注意力集形成的标准为解决额外维度转换（EDS）任务比前一阶段多至少两次试验。
- MP 分析：用于 MP 分离和分析的试剂和溶液均过滤，用流式细胞仪和特定软件分析 MPs，MPs 定义为 annexin V 阳性、直径 0.3 - 1μm 的颗粒。
- 蛋白质免疫印迹法：行为评估后处死小鼠，采集大脑制备蛋白样本，测定蛋白浓度后进行凝胶电泳和转膜，用特定抗体孵育和检测蛋白条带。
- 统计分析：结果以均值 ± 标准差表示，使用 SigmaStat 软件分析，通过 Shapiro - Wilk 检验评估数据正态性，根据不同比较情况选择合适的统计方法，P < 0.05 认为具有统计学意义。
致谢
感谢急诊科医生和护士在获取血液样本方面的热情合作。本研究得到美国海军研究办公室（S.R.T.）和美国国立神经疾病与中风研究所（S.R.T.）的资助。众多人员参与了研究的各个环节，包括概念构思、方法设计、调查研究、数据可视化、监督管理、资金获取等，且作者声明无利益冲突，文中数据和材料可用于评估研究结论。
