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本文开发了高通量内源性荧光蛋白标记技术（CyanoTag）用于蓝藻（Synechococcus elongatus）PCC 7942 的研究。通过标记超 330 种蛋白，在亚细胞定位、蛋白丰度及互作网络等方面取得重要发现，为蓝藻生物学研究提供了关键资源与方法，极具价值。
研究背景
蓝藻在维持地球大气和生态系统方面发挥着至关重要的作用。它们对全球 CO2固定、O2产生和营养循环贡献巨大，还通过古老的内共生事件影响了真核生物叶绿体的进化，许多光合基因和核心代谢过程在蓝藻和真核叶绿体中保持保守。此外，蓝藻的多样性、遗传可操作性和光合能力使其成为绿色生物技术应用的有前景的底盘。
然而，尽管蓝藻具有重要的全球意义且在研究中广泛应用，但被表征的蓝藻蛋白比例却很小。在模式生物如酵母、线虫、果蝇和人类细胞等的研究中，大规模标记方法已带来重要的见解，但在细菌系统尤其是光合细菌中，大规模标记的应用还很有限，内源性、无痕荧光蛋白标记在光合系统中的大规模应用也尚未实现。因此，开发一种用于研究蓝藻蛋白质功能的高通量标记技术迫在眉睫。
CyanoTag 技术的开发
为了深入了解蓝藻（Synechococcus elongatus）PCC 7942 的蛋白质组，研究人员开发了 CyanoTag 技术，该技术可在蛋白质的天然 C 末端进行无痕标记，以便研究蛋白质的亚细胞定位、相对丰度和相互作用蛋白。
研究人员采用了一种改进的 Golden Gate 克隆方法来构建质粒。在构建过程中，将两个同源臂（HAs）通过 PCR 从基因组 DNA 中扩增出来，然后利用 BsaI 或 BspQI 依赖的 Golden Gate 克隆反应，将其插入到含有一系列标记和选择模块的骨干质粒中，取代两个编码细胞毒素的（ccdB）基因。这些模块包括一个明亮的单体绿色荧光蛋白（GFP）mNeonGreen（mNG）和一个 3xFLAG 表位的标记模块、一个卡那霉素抗生素选择标记（nptI）以及一个负选择标记（codA），随后是第二个 mNG/3xFLAG 模块。
将构建好的质粒分别转化到蓝藻中，通过卡那霉素抗性筛选转基因整合。由于蓝藻是多倍体，研究人员使用逐渐增加浓度的卡那霉素来最终分离出同质的 “标记” 突变体，即感兴趣基因的每个染色体拷贝都被修饰。为了去除选择标记以创建 “无标记 ” 的标记突变体，研究人员利用 5 - 氟胞嘧啶（5 - FC）诱导侧翼 mNG 基因的第二轮同源重组，5 - FC 会被 codA 基因产物水解为细胞毒性的 5 - 氟尿嘧啶，从而实现负选择。
研究人员在 400 个靶基因上测试了该流程，最终成功为 330 个（82.5%）靶基因生成了 mNG 整合的突变体并分离出同质标记突变体。该标记成功率与其他大规模内源性标记研究相当，且高于光合藻类莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的外源标记成功率。
蛋白质定位研究
研究人员利用超分辨率结构光照明显微镜（SIM）观察了 322 个无标记突变体中 mNG 的荧光。为了便于对每个标记蓝藻菌株的荧光蛋白分布进行分类，研究人员构建了一个决策树，根据 mNG 荧光模式及其与细胞自发荧光（主要来自类囊体膜中的色素）的关系进行分类。通过这种方法，研究人员用与弥散模式（D）、膜模式（M）或斑点（P）相关的描述符来描述观察到的荧光模式。
在观察过程中，研究人员发现了一系列独特或以前未描述过的定位模式。例如，标记已知的羧酶体蛋白的三条线中，观察到 mNG 荧光沿着细胞中心轴呈现特征性的斑点模式（P1）。对于一些功能未知的蓝藻蛋白，如 Synpcc7942_2044，研究人员发现了其新的定位，它定位于类囊体外的不同斑点，这暗示了可能存在未知的调节机制或完全不同的功能。
此外，研究人员还发现，少数（<9%）蛋白质不能整齐地归入单一的定位类别。例如，Vipp1 蛋白（Synpcc7942_0794）在大多数细胞中表现为弥散的细胞质定位，但在其他细胞中则在细胞周边出现非常明亮的斑点。同时，一些蛋白质的定位与预期不符，如羧酶体外壳成分 CcmP 和 CcmL，它们在完全分离的情况下显示出弥散的模式，而不是预期的羧酶体的明确斑点模式，这可能是由于标签的空间位阻影响了外壳的正确组装。
体内蛋白质丰度筛选
由于无标记突变体中保留了天然的顺式和反式调控元件，研究人员假设 mNG 标记的蛋白质丰度与未标记版本相似，因此 mNG 可作为蛋白质丰度的良好指标。基于此，研究人员开发了一种基于流式细胞术的荧光测定法，用于在标准生长条件下测定活细胞中蛋白质的相对丰度。
研究发现，荧光强度与蛋白质的亚细胞定位密切相关，并且通过流式细胞术观察到的表达水平趋势与已发表的质谱数据集大致相符。然而，对四个标记品系和野生型进行的无标记数据独立采集（DIA）蛋白质组学分析表明，标记会导致蛋白质水平系统性降低约 50%（34% - 58%）。在两个测试的标记品系 Prk 和 Gap2 中，它们形成已知的复合物，标记导致复合物伙伴的共同减少。此外，研究还发现了两个在 mNG 标记品系中持续上调的蛋白质，这表明蓝藻中可能存在一种机制来降解和分泌荧光团标记的蛋白质，可能是由于蛋白质稳定性的变化。
蛋白质相互作用网络的绘制
为了探索蓝藻中的蛋白质 - 蛋白质相互作用网络，研究人员开发了亲和纯化 - 质谱（AP - MS）方法，并将其应用于最初的一组无标记 CyanoTag 品系。研究人员还开发了一种生物信息学流程来过滤质谱数据，使用 CompPASS 和 SAINT 分析相结合的方法，为 82 个诱饵蛋白中的每一个定义高置信度相互作用蛋白（HCIs）。
通过对这些初始诱饵蛋白的数据整理，研究人员鉴定出了对应于 1617 种独特猎物蛋白的两个或更多肽段，这些猎物蛋白约占整个蓝藻蛋白质组的 60%。在检测到的 56422 种蛋白质相互作用中，经过筛选，有 369 种通过阈值成为 HCIs。这些数据被汇编成一个初步的蛋白质相互作用组，包括 82 个诱饵和 135 种独特的猎物蛋白，其中包括先前已表征的相互作用以及突出了先前未识别的相互作用。
这个相互作用组图涵盖了多个已知大型蛋白质复合物内部和之间的相互作用，如光系统 I 和 II（PS - I 和 PS - II）、NDH1 复合物、硝酸盐转运蛋白和生物钟调节蛋白 KaiABC。研究还发现了一些以前未描述的相互作用，例如，未表征的猎物蛋白 Synpcc7942_0551 与 NDH1 - MS 复合物的三个亚基相互作用，这表明 AP - MS 流程有足够的能力解析蛋白质复合物内特定区域的以前未描述的相互作用。
Calvin 循环调节的研究
在开发 CyanoTag 技术的过程中，研究人员观察到了许多与 Calvin 循环调节相关的有趣现象。研究人员发现 Synpcc7942_0252 可能是 Gap2 和 Prk 的相互作用蛋白，它含有一个 Cp12 样结构域，但表达水平比 Cp12 低得多。通过流式细胞术和荧光显微镜检测，研究人员发现黑暗处理数小时后，mNG 标记的 Synpcc7942_0252 荧光增加。
已知 Cp12 是 Calvin 循环的调节因子，在不利于糖生产的条件下，它会结合 Gap2 和 Prk，使它们远离循环。标记 Gap2 和 Prk 后，研究人员能够实时观察到这个过程，发现光照去除后，这些标记蛋白会在几秒钟内从弥散定位模式迅速重新定位到明显的斑点，并且这些斑点具有高度动态性，能够融合和快速可逆。虽然这些动态特性与通过液 - 液相分离形成的生物分子凝聚物有关，但还需要进一步的体内和体外数据来确定。此外，研究发现，在没有 Synpcc7942_0252 的情况下，斑点仍然可以形成，这表明这种相互作用对黑暗诱导的蛋白质重新定位不是必需的，Synpcc7942_0252 可能在 Gap2/Prk 斑点形成后发挥作用。
蛋白质功能的探索
通过标记以前未表征的蛋白质，研究人员可以深入了解它们的功能。例如，标记 Synpcc7942_0011 后，研究人员发现其在细胞分裂过程中，子细胞分离的连接处信号最强，这表明它可能在细胞分裂过程中发挥作用。为了进一步研究其功能，研究人员构建了该基因的敲除品系，发现敲除后细胞大小和形状没有明显变化，生长速率仅略有受损，这表明在标准条件下，该蛋白不是必需的，但它在细胞分裂位点的具体作用还需要进一步研究。
此外，研究人员在对三个 CyanoTag 品系进行荧光成像时，观察到了一些显著的细胞形状表型。标记 Synpcc7942_2059（SepF）或 Synpcc7942_2378（FtsZ）会导致细胞伸长，而标记 Synpcc7942_1104（RodA）会导致细胞变短变宽。这些形态变化与这些蛋白质在细胞分裂和细胞壁合成中的预期功能相符，也表明融合标签对蛋白质功能的影响虽然是荧光蛋白标记的一个公认的问题，但在某些情况下也可以为研究蛋白质功能提供线索。
研究的意义、局限性与展望
研究人员开发的 CyanoTag 技术是一种强大的高通量工具，可用于生成表达 mNG 标记蛋白质的蓝藻细胞系，从多个方面对 330 多种蛋白质进行了深入研究，获得了许多重要的见解，如 Calvin 循环关键蛋白的时空调节、蛋白质相互作用组的绘制以及对一些未知功能蛋白质的初步功能探索等。研究数据已通过在线平台公开，研究人员还愿意与其他研究人员分享 CyanoTag 细胞系和详细的实验方案，为蓝藻研究社区提供了重要的资源。
然而，该研究也存在一些局限性。例如，在蛋白质的内源性位点进行无痕标记虽然保留了天然调控元件，但仍可能影响下游基因的表达，标签的添加也可能损害蛋白质的正常功能、定位、相互作用和丰度。此外，荧光蛋白在细菌中的正确转运和折叠、标签的切割、转录 / 翻译起始位点的变化以及标签位置对蛋白质靶向和调节的影响等问题也需要考虑。同时，研究中成像条件可能无法反映蛋白质的最佳表达和功能状态，且数据集也未捕捉到蛋白质表达的振荡。
尽管存在这些局限性，CyanoTag 技术仍为蓝藻生物学研究提供了重要的基础。随着研究的不断推进，研究人员将继续扩大蛋白质组覆盖范围，有望观察到更多新颖的生物学现象，生成第一个实验定义的光合生物全细胞相互作用组，为解决全球粮食安全、生态系统保护和气候变化等重大挑战提供帮助。
