揭秘 PTEN 缺失型前列腺癌对 Akt 抑制耐药机制：mTOR 信号通路的关键作用

本文聚焦 PTEN 缺失型前列腺癌，研究发现恢复 mTOR 信号是对 Akt 抑制耐药的早期主导驱动因素。通过多种实验，揭示耐药机制及相关分子改变，提出联合抑制 Akt 和 mTOR 或可克服耐药，为前列腺癌精准治疗提供新思路。（PTEN：磷酸酶和张力蛋白同源物；mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；Akt：蛋白激酶 B）

　　### 引言
在转移性前列腺癌中，磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）信号通路激活相关的分子改变（如 PTEN 缺失和 PIK3CA/B 突变）很常见，超过 60% 的肿瘤标本存在此类改变。雄激素受体（AR）抑制是转移性前列腺癌的主要治疗手段，但 PTEN 缺失和异常的 PI3K 信号会导致对 AR 靶向治疗产生耐药。PI3K 信号轴成为转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）的治疗靶点，已有多种针对该通路不同节点的抑制剂被开发。

此前研究发现 PI3K 和 AR 信号通路在 PTEN 缺失背景下存在相互抑制调节，这解释了单药 PI3K/mTOR 通路抑制剂临床试验失败的原因，也促使开展联合抑制 PI3K 和 AR 通路的临床试验。近期，Akt 抑制剂 ipatasertib 联合 AR 通路抑制剂醋酸阿比特龙的 3 期临床试验显示，可显著改善 PTEN 缺失的 mCRPC 患者的影像学无进展生存期。此外，携带导致 PI3K 信号激活的基因组改变（PTEN 缺失、PIK3CA 突变和 Akt 突变）的患者，接受联合治疗比单独使用醋酸阿比特龙总生存期延长超过 6 个月。同时，PIK3CA 突变的乳腺癌临床试验也表明，PIK3CA 选择性抑制剂 alpelisib 与雌激素受体（ER）降解剂 fulvesterant 联合使用可改善影像学无进展生存期。

过去前列腺癌临床前模型对治疗反应和耐药性的研究受限于可用细胞系较少。近年来，前列腺癌类器官培养方法的发展使研究人员能够建立多种患者来源的模型，这些模型能代表 mCRPC 的遗传、组织学和 AR 抑制剂反应的多样性。结合已有的前列腺癌细胞系和患者来源的前列腺癌类器官，有助于更深入地研究治疗反应和耐药性机制，优化患者选择，制定联合和序贯治疗策略。

结果

1. PTEN 缺失模型对 Akt 抑制的敏感性差异：研究人员使用等基因对 CWR22Pc - EP、MSK - PCa15 和 MSK - PCa16，通过 CRISPR - Cas9 敲除 PTEN，在体外生长试验中发现 PTEN 缺失会增强对 ipatasertib（500 nM）的敏感性。Western blot 分析证实，PTEN 缺失、PI3K 信号激活和 Akt 抑制（ipatasertib，500 nM；4 小时）会导致 Akt 通路蛋白（如 PRAS40 和 S6）的磷酸化下调。在 AR 依赖的 CWR22Pc - EP 模型中，Akt 抑制会增加 AR 靶基因前列腺特异性抗原（PSA）的表达，这种增加可被 AR 抑制剂恩杂鲁胺（enzalutamide，10 μM，12 小时）抑制。

研究人员进一步对多种内源性 PTEN 缺失的前列腺癌类器官和细胞系进行研究，用 ipatasertib（500 nM）和 / 或 enzalutamide（10 μM）处理后进行体外生长试验。Western blot 分析表明，ipatasertib（500 nM，4 小时）急性抑制 Akt 会导致 Akt/mTOR 通路下调。大多数 PTEN 缺失模型对 Akt 和 / 或 AR 抑制敏感，但不同模型存在差异，PCa3 和 PCa8 对 Akt 抑制更具抗性。

通过分析前列腺癌类器官模型的 MSK Impact 基因组分析数据，发现 PCa3 存在 TMPRSS2:ERG 基因重排，导致 ERG 异常表达，这会促进对联合 PI3K 和 AR 通路抑制的抗性。PCa8 是最具抗性的 PTEN 缺失模型，存在基因间融合，导致表皮生长因子受体变体 III（EGFRvIII）表达，Akt 抑制对其细胞增殖和下游 mTOR 信号影响较小。PCa8 具有活跃的 MAPK 和 PI3K 信号，单药抑制 MEK（PD0325901，1 μM）或 Akt（ipatasertib，500 nM）对细胞增殖影响不显著，联合抑制 MEK 和 Akt 可抑制细胞增殖，加入 EGFR 抑制剂吉非替尼（gefitinib，1 μM）效果更明显。CRISPR - Cas9 敲除 EGFR 后，可降低下游 EGFR 信号，添加 ipatasertib 进一步抑制 mTOR 信号，抑制细胞增殖。这些数据表明，PTEN 缺失虽使肿瘤对联合 Akt 和 AR 抑制更敏感，但 PTEN 缺失模型间存在固有差异敏感性，由伴随的分子改变导致。

2. mTOR 信号恢复驱动对 Akt 抑制的获得性耐药：为研究 Akt 抑制相关的耐药机制，研究人员建立了体内临床前模型（PCa12），该模型对 Akt 和 AR 抑制部分敏感。小鼠接受 ipatasertib（50 mg/kg/ 天）、去势和 enzalutamide（10 mg/kg/ 天）联合治疗，监测肿瘤体积直至出现耐药。出现耐药后，从对照肿瘤和耐药肿瘤中建立前列腺癌类器官。体外细胞增殖研究表明，耐药细胞系对 Akt（ipatasertib，500 nM）抑制的反应比对照细胞系弱。在获得性耐药模型中，持续观察到下游 mTOR 信号增加，且对上游 Akt（ipatasertib，500 nM；4 小时）抑制不敏感。

研究人员使用不同浓度的 ipatasertib 或 Akt 变构位点抑制剂 MK2206 进行测试，发现耐药细胞系中两者的半数抑制浓度（IC₅₀）剂量 - 反应曲线右移。即使在高微摩尔剂量的 MK2206 下，耐药模型中 mTOR 信号也未被抑制，表明 mTOR 活性与 Akt 信号解偶联。用 mTORC1 抑制剂 RAD001（100 nM，4 小时）联合 ipatasertib（500 nM，4 小时）或 mTOR 催化位点抑制剂 INK128（100 nM；4 小时）处理，可恢复细胞对 Akt 抑制的敏感性。

在 AR 依赖的 CWR22Pc - EP 细胞系中敲除 PTEN 后进行体内研究，发现急性（3 天）用 ipatasertib（50 mg/kg/ 天）处理，Akt 和 mTOR 靶蛋白的磷酸化均下降；但长期（4 周）处理出现获得性耐药后，mTOR 信号恢复，且 AR 抑制在整个研究过程中持续存在，表明早期获得性耐药与 Akt/mTOR 信号恢复有关，而非 AR 信号。

3. 全基因组敲除筛选确定耐药机制：为确定 PTEN 缺失背景下对 Akt 抑制耐药的机制，研究人员在 PTEN 缺失的 LNCaP 细胞系中进行全基因组 CRISPR 筛选。统计分析发现，在 ipatasertib 处理条件下，mTOR 的负调节因子显著富集，如结节性硬化症复合物（TSC）（TSC1 和 TSC2）、GATOR1 复合物（NPRL2、NPRL3 和 DEPDC5）和 KICKSTOR 复合物（C12orf66、KPTN、ITFG2 和 SZT2）的组成基因。

敲除 LNCaP 细胞中的 TSC2 后，下游 mTOR 信号对 Akt 抑制（ipatasertib，500 nM；4 小时）的反应明显减弱，体外竞争试验表明敲除 TSC2 会促进对 Akt 抑制剂 ipatasertib（500 nM）的抗性。敲除 NPRL3、KPTN 或 SZT2 也会使 LNCaP 细胞对 Akt 抑制产生抗性，敲除 NPRL3 会使多个 Akt 抑制剂敏感细胞系对 Akt 抑制产生抗性，且下游 mTOR 信号未明显减弱。体内研究发现，敲除 NPRL3 会促进对联合 ipatasertib（50 mg/kg/ 天）和去势治疗的抗性，用 INK128 抑制 mTOR 可恢复敏感性。

研究还发现，获得性耐药细胞系对氨基酸刺激的 mTOR 信号超敏感，但对 Akt 抑制无反应。这表明 mTOR 信号恢复是对 Akt 抑制耐药的关键机制，可通过多种遗传和适应性营养调节过程实现，抑制 mTOR 可恢复对 Akt 抑制的敏感性。

4. mTOR 与自噬在耐药中的作用：自噬是细胞通过溶酶体依赖的调节机制降解和回收细胞产物及营养物质以促进细胞存活的生理过程，在营养饥饿、致癌激活和 mTOR 信号抑制等细胞应激时活跃。研究人员发现，在部分对 Akt 抑制获得性耐药的模型中，自噬相关标记物表达增加，如 GCN2、ATG4C 和 pEIF2α 水平升高。

用晚期自噬抑制剂巴弗洛霉素 A1（bafilomycin A1，1 nM）处理耐药模型，可使 LC3A/B 快速积累、脂化的 LC3B（II）增加、pS6 下调，去除 bafilomycin A1 后，pS6 和 LC3A/B 水平恢复到基线。体外生长试验表明，部分耐药模型对低纳摩尔剂量的 bafilomycin A1 敏感，部分不敏感，说明自噬和内体营养物质再加工在对 bafilomycin A1 敏感的模型中促进了对 ipatasertib 的抗性。

在 bafilomycin A1 敏感的 R5 细胞系中，添加 bafilomycin A1 与 ipatasertib 可抑制下游 mTOR 信号，去除 bafilomycin A1 后信号恢复；而在 bafilomycin A1 不敏感的 R4 细胞系中未观察到这种现象。所有耐药模型对 mTORC1/2 抑制（INK128，100 nM）均敏感，这突出了 mTOR 下游信号在促进对 Akt 抑制耐药中的关键作用。

讨论

近十年来，高危局部晚期和转移性前列腺癌的治疗发生了显著变化。除了靶向 AR 和雄激素轴的治疗外，基于前列腺癌分子改变的精准治疗也在发展，如聚（腺苷 5′ - 二磷酸 - 核糖）聚合酶抑制剂在 BRCA1/2 改变的前列腺癌、检查点抑制剂在 MSH 改变的前列腺癌中取得良好效果。Akt 抑制剂联合第二代 AR 通路抑制剂在 PTEN 缺失的 mCRPC 中也显示出疗效。

之前的研究为前列腺癌联合 PI3K 和 AR 通路抑制的临床试验奠定了基础，而当前研究进一步揭示了 PTEN 缺失的前列腺癌对治疗反应的多样性，明确了反应和耐药的机制。研究发现，对联合 Akt 和 AR 抑制耐药的主要机制是下游 mTOR 信号的恢复，添加靶向 mTOR 的药物可恢复对 Akt 抑制的敏感性。

全基因组 CRISPR 筛选发现，mTOR 负调节因子的缺失会导致 Akt 与 mTOR 信号解偶联，使 mTOR 信号持续激活，这与之前在 ER 阳性 PIK3CA 突变的乳腺癌研究结果一致，且这种耐药可通过靶向 mTOR 克服。在获得性耐药模型中，虽然未发现 TSC 或 GATOR1/KICSTOR 复合物的分子改变，但 mTOR 信号对氨基酸刺激超敏感，且自噬标记物上调，表明细胞营养和氨基酸循环在恢复 mTOR 信号中起作用。在部分耐药模型中，mTOR 信号的恢复依赖自噬和细胞营养物质的回收，这些模型对自噬依赖以维持细胞存活和增殖。

综上所述，mTOR 信号恢复是对 Akt 抑制耐药的重要机制，添加 mTOR 抑制剂或抑制自噬过程可能恢复对 Akt 抑制的敏感性，这对前列腺癌的临床治疗具有重要意义。

方法

1. 患者来源的前列腺癌类器官和细胞系：按照之前描述的方法生成患者来源的类器官（PDOs），如 MSK - PCa1、MSK - PCa2 等，并在标准类器官培养条件下培养和维持。CWR22Pc - EP 细胞系按既定方案生成和维持，LNCaP 细胞系（ATCC CRL - 1740）和 CWR22Pc - EP 细胞系在含 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基中培养。在 Pca15、Pca16 类器官和 CWR22Pc - EP 细胞中敲除 PTEN。同时建立了 ipatasertib 耐药细胞系 R1 - R12 和对照细胞系 C，所有细胞系和类器官均检测支原体呈阴性。
2. 治疗药物：Akt 抑制剂 ipatasertib 由 Genentech 提供，用于体内研究时溶解在 0.5% 甲基纤维素和 0.2% 吐温 80 溶液中。AR 抑制剂 enzalutamide 由 MSKCC 化学核心合成。从 Selleck Chemicals 购买 MK2206、PD0325901、Gefitinib、INK128 和 RAD001，从 Thermo Fisher Scientific 购买 Bafilomycin A1。
3. 免疫印迹：用放射免疫沉淀分析缓冲液制备细胞裂解物，在 NuPAGE Novex 4 - 12% Bis - Tris 蛋白凝胶上分离蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯膜上。用 5% 牛血清白蛋白在含吐温 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）中封闭，4°C 孵育过夜一抗，室温孵育 1 小时二抗。所有免疫印迹均进行三个独立生物学重复。使用多种抗体进行 Western blotting 检测不同蛋白。
4. 基于 CellTiter - Glo 的细胞活力测定：在 96 孔板中接种不同数量的人源类器官、CWR22Pc - EP 细胞或 LNCaP 细胞，第二天加入药物，72 小时后补充培养基和药物，第 7 天用 CellTiter - Glo 发光细胞活力测定试剂盒检测细胞活力，所有细胞增殖试验至少重复两次独立生物学重复。
5. RNP 介导的 CRISPR 基因组编辑：将 Cas9 核酸酶与 1.2 μM 单向导 RNA（sgRNA）孵育形成 Cas9 - 核糖核蛋白（cRNP）复合物。将解离的类器官细胞与 cRNP 复合物和电穿孔增强剂混合，进行电穿孔，然后离心并接种培养。使用不同的 sgRNA 靶序列进行基因编辑。
6. 小鼠异种移植实验：将 2×10⁶ - 5×10⁶个细胞皮下植入 6 - 8 周龄雄性 NSG 小鼠，肿瘤体积达到 200 - 300 mm³时进行去势。治疗组小鼠从周一到周五口服 ipatasertib（50 mg/kg/ 天）和 enzalutamide（10 mg/kg/ 天），每周测量肿瘤大小，所有实验严格遵循批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议。
7. 全基因组 CRISPR - Cas9 敲除筛选：使用人类 CRISPR Brunello 敲除文库进行筛选，将携带 sgRNA 文库的慢病毒以 0.33 的感染复数（MOI）导入 5.6 亿个 LNCaP 细胞，确保文库 1000 倍覆盖。文库转导细胞用 DMSO 或 ipatasertib（495 nM）处理 18 天。对筛选数据进行预处理、过滤和分析，确定富集和缺失的基因。
8. 竞争性细胞生长验证试验：用 Lipofectamine 2000 将 Cas9 表达构建体转染到 293 T 细胞中产生慢病毒，感染 LNCaP 细胞后筛选，再用携带 sgNT - 绿色荧光蛋白（GFP）或靶向特定基因的 sgRNA - GFP 的慢病毒转导，处理细胞后用流式细胞术监测 GFP 比例。
9. 免疫印迹结果定量：使用 Fiji 对免疫印迹分析结果进行定量，将每个蛋白条带先与相应对照条带（如 HSP90 或 β - 肌动蛋白）归一化，再将所有处理样本与对照样本归一化。
10. 免疫组化切片定量：用 Pannoramic Flash 扫描免疫组化切片，用 Slideviewer 绘制感兴趣区域并导出为.tif 文件，再用 ImageJ/Fiji 进行处理，通过颜色反卷积、阈值设定和面积测量等操作，计算阳性染色细胞的百分比。
11. 研究批准：所有涉及动物的实验均获得 MSKCC 动物伦理委员会批准（IACUC 协议 06 - 07 - 012）。

致谢

本研究得到多项资助，众多作者参与研究的各个环节，部分作者存在潜在利益冲突。所有数据均在论文和补充材料中，可用于评估研究结论。