单链 DNA 结合转录因子 PafBC 触发分枝杆菌 DNA 损伤反应：机制解析与潜在意义

本文聚焦分枝杆菌 DNA 损伤反应，研究发现单链 DNA（ssDNA）与转录因子 PafBC 的 WYL 结构域结合可激活该因子，通过冷冻电镜解析其活性构象结构，揭示了相关分子机制，为深入理解分枝杆菌 DNA 损伤修复提供关键依据。

　　### 引言
分枝杆菌，如结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb），常面临不利环境导致 DNA 损伤。为维持基因组完整性和生存，它们会诱导参与 DNA 修复、重组和复制的基因表达。其中，多数 DNA 损伤反应基因（约 150 个）由异源二聚体调节因子 PafBC（PafBC 依赖途径）控制，PafBC 属于含 WYL 结构域的蛋白质家族。

WYL 结构域得名于特定序列，但该序列并非所有成员都有，其共有特征是保守的带正电配体结合凹槽，可作为信号转导模块。除 PafBC 外，还有其他含 WYL 结构域的转录因子，如转录抑制因子和激活因子 SiwR、DriD 等，不过 PafBC 及其直系同源物是目前唯一已知的异源二聚体。

此前对含 WYL 结构域蛋白的研究获得了一些结构信息，如Arthrobacter aurescens（Aau）PafBC 的晶体结构，其 WYL 结构域呈 Sm 折叠，与 RNA 结合蛋白类似。有研究推测 PafBC 的 WYL 结构域可能作为核酸结合位点，将应激信号转化为激活构象变化，且在单链 DNA（ssDNA）存在时，PafBC 与 RNA 聚合酶（RNAP）的相互作用增强。

PafBC 调节基因的激活机制也有进展，通过冷冻电镜（cryo-EM）解析M. smegmatis中 PafBC 结合的转录起始复合物结构发现，在 DNA 损伤条件下，PafBC 可使管家 RNAP 全酶与 sigma 因子 A（SigA/σ^A）结合到 PafBC 依赖的启动子上，即 sigma 适应过程。然而，DNA 损伤如何激活 PafBC 的机制仍不明确。

结果

1. PafBC 被 WYL 结构域的 ssDNA 结合激活：PafBC 依赖的转录激活需其与 RNAP-σ^A全酶结合到含特定启动子基序的双链 DNA（dsDNA）上。在下拉实验中，添加 12 核苷酸（nt）长的 ssDNA 分子可显著增加 PafBC 与 RNAP 的结合量，表明 PafBC 可被 ssDNA 结合激活。

为探究哪种形式的 ssDNA 可作为应激信号配体及激活程度，研究人员进行了体外转录实验。以 “Broccoli” RNA 适体与 3,5 - 二氟 - 4 - 羟基苄叉咪唑啉酮（DFHBI）形成荧光复合物为检测手段，使用含 PafBC 依赖启动子和 RNA 适体编码序列的 dsDNA 模板进行转录反应。结果显示，添加 ssDNA 可使荧光显著增强，表明转录增加，且该激活严格依赖 PafBC；而添加单链 RNA（ssRNA）或多种核苷酸第二信使（如 cAMP、cGAMP、pppGpp 等）均未引起转录激活。

进一步研究发现，聚胸苷酸（dT）ssDNA 激活 PafBC 的效率最高，且较长的 ssDNA 激活效果更好，6 nt 的 ssDNA 就能引起转录明显增加，但过长的 ssDNA（超过 12 nt）会因非特异性结合 RNAP-σ^A而抑制转录。

通过电泳迁移率变动分析（EMSAs）表明，野生型（WT）PafBC 与 ssDNA 结合亲和力为低微摩尔级，而突变两个高度保守精氨酸残基的 PafBC 变体（WYL RR）则无法结合 ssDNA，且添加 ssDNA 时也无转录激活，这证实了 ssDNA 与 WYL 结构域的结合是激活 PafBC 的关键步骤。
2. PafBC 与 RNAP-σ^A结合需 RNAP-σ^A先结合 PafBC 特异性启动子 DNA：利用 EMSAs 研究 RNAP-PafBC 转录起始复合物形成过程中各分子的结合顺序。为稳定分枝杆菌 RNAP-σ^A开放复合物，在 dsDNA 模板的 - 10 区域引入非互补转录泡。

实验结果表明，在无 RNAP 全酶时，PafBC 无论是否有 ssDNA 配体，都不与含 PafBC 特异性启动子基序的 dsDNA 结合；而 RNAP-σ^A可非特异性结合 dsDNA。在无 ssDNA 时，添加 PafBC 到与 dsDNA 结合的 RNAP-σ^A上不会形成 RNAP-PafBC 复合物；只有当 ssDNA 存在且 RNAP-σ^A结合到 PafBC 特异性启动子 DNA 上时，才会出现复合物形成的迁移率变化。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析也显示，当 RNAP-σ^A未结合启动子模板时，无论是否有 ssDNA，都不会形成 RNAP-PafBC 复合物。这些结果表明，PafBC 需先被 ssDNA 激活，然后才能与已结合 PafBC 特异性启动子 DNA 的 RNAP-σ^A结合。
3. PafBC 活性构象的冷冻电镜结构：为解析 PafBC 全长的活性转录起始复合物结构，研究人员在纯化 RNAP-PafBC 复合物前进行甲醛交联，再通过尺寸排阻色谱法纯化。最初在有 CarD（一种分枝杆菌中重要的全局转录调节因子）存在下收集冷冻电镜数据，虽发现 CarD 可增加 PafBC 介导的转录，但因其增加了粒子异质性，后续实验将其排除。

对不含 CarD 的 RNAP-PafBC 转录起始复合物进行冷冻电镜单粒子分析，得到了 PafBC 全长结构。该复合物包含 RNAP、SigA、RbpA、PafBC、含 PafBC 依赖启动子的 dsDNA 及 11 nt 长的 ssDNA。由于 PafBC 相对于 RNAP 全酶构象异质性较大，分别对两者进行精修，PafBC 分辨率达 4.0 ?，RNAP 全酶分辨率达 3.3 ?，然后将两个三维重建结果合并得到完整复合物的复合图。

在转录复合物中，PafBC 呈细长的伪二重对称结构，PafB 和 PafC 构象相似但不完全相同。HTH 结构域通过长连接子与 WYL 结构域相连，连接子形成四螺旋束，与 AauPafBC 晶体结构中的连接子不同。WYL 结构域位于异源二聚体最宽处，通过柔性连接子与 WCX 结构域相连，WCX 结构域的折叠和相互作用与 AauPafBC 的 WCX 结构域相似。
4. PafBC 形成 ssDNA 结合隧道：在与 RNAP 结合的 PafBC 结构中，WYL 结构域的配体结合凹槽朝向 WCX 结构域，在 PafBC 模型的表面表示中，WYL 和 WCX 结构域之间有一个明显的隧道贯穿整个异源二聚体。Fo - Fc 差异密度图显示该隧道内有额外密度，连接 PafB 和 PafC 的 WYL 结构域，且对 ssDNA 结合至关重要的精氨酸残基朝向该额外密度，证实其为 ssDNA 配体，表明该结构捕获了与 ssDNA 结合的活性态 PafBC。

通过对 PafB 和 PafC WYL 结构域中保守精氨酸残基进行突变研究发现，PafB WYL 结构域突变会完全消除 ssDNA 结合能力，而 PafC WYL 结构域突变后结合能力与 WT PafBC 相似。进一步突变 PafB WYL 结构域的其他保守残基，如形成正电荷补丁的精氨酸残基和 WYL 基序中的酪氨酸残基，均导致 ssDNA 结合完全丧失，且部分突变体与 RNAP - σ^A形成复合物的能力也显著下降，这突出了 PafB WYL 结构域在 ssDNA 结合和转录激活中的关键作用。

此外，分析凝胶过滤实验表明，PafBC 与 ssDNA 的化学计量比约为 1:1，与冷冻电镜模型一致。对位于 ssDNA 结合隧道中心的芳香族残基突变的 PafBC 变体研究发现，该变体仍能结合 ssDNA 和 RNAP 全酶，但结合能力有所下降，进一步证明 ssDNA 穿过结合隧道。
5. PafBC 可结合 ssDNA 缺口：研究人员推测在生理条件下，ssDNA 与 PafBC 的结合主要取决于 ssDNA 浓度。通过体外转录实验验证，在反应 15 分钟后添加单链 DNA 特异性核酸外切酶 I（ExoI），结果显示添加 ExoI 的反应转录水平急剧下降，而对照反应转录水平持续上升，表明 ssDNA 从 PafBC 上解离与其他因素无关，支持了 ssDNA 浓度调节 PafBC 活性的模型。

结构分析显示 ssDNA 结合在 PafBC 拓扑封闭的结合隧道内，为探究 PafBC 结合是否需要游离 ssDNA 末端及体内激活 PafBC 的 ssDNA 来源，使用含 dT12 ssDNA 片段且两侧为发夹环的荧光标记 DNA 构建体进行 EMSAs 实验。结果表明，PafBC 能结合该构建体，而不能与仅含 DNA 发夹的对照构建体结合，说明游离 ssDNA 末端并非 PafBC 结合所必需。综合这些结果，支持了 ssDNA 先与 PafB WYL 结构域结合引发 PafBC 构象变化，进而形成 ssDNA - PafBC 复合物的模型。

讨论

分枝杆菌的 DNA 损伤反应由 PafBC 激活，它属于含 WYL 结构域的蛋白家族。此前虽已揭示 PafBC 通过 sigma 适应激活转录的机制，但 DNA 损伤如何激活 PafBC 尚不清楚。本研究通过结构和生化证据表明，ssDNA 通过跨异源二聚体最宽部分的结合隧道与 PafBC 的 WYL 结构域结合，从而激活 PafBC。

ssDNA 是 DNA 损伤的标志，在真核生物和原核生物中，DNA 损伤时会产生 ssDNA，如双链断裂处的 DNA 末端切除或复制叉停滞。细菌的经典 DNA 损伤反应途径 SOS 反应由 RecA 丝激活，RecA 丝围绕 ssDNA 位点形成并促进阻遏蛋白 LexA 的自催化裂解。而本研究发现 PafBC 特异性地被 ssDNA 激活，且不依赖游离 ssDNA 末端，推测其可被多种来源的 ssDNA 激活，如 DNA 末端切除产生的 ssDNA 尾巴、短的游离 ssDNA 片段和 ssDNA 缺口等，但这些 ssDNA 来源可能需在局部发挥作用。

RecA 和 PafBC 都被 ssDNA 激活，这引发了为何分枝杆菌和其他放线菌进化出两条不同的 DNA 损伤修复途径的疑问。研究表明，较长的 ssDNA 分子更能有效激活 PafBC，而短至 6 nt 的 ssDNA 也能诱导一定程度的激活，这表明 PafBC 可响应 RecA 无法用于原丝成核的较短 ssDNA 片段。此外，两者激活的差异可能源于 DNA 修饰或其他蛋白的参与。

此前研究显示，SOS 反应和 PafBC 依赖途径对分枝杆菌在不同条件下的 DNA 损伤修复都很重要，如 SOS 反应对紫外线辐射损伤修复重要，PafBC 对 gyrase 抑制后的生存至关重要。这可能反映了不同 DNA 损伤剂产生的 ssDNA 类型差异，两条途径的进化增强了 DNA 损伤反应的稳健性，提供了更好的时间调控和适应性。未来研究两者对 ssDNA 的竞争及 ssDNA 配体的差异，对阐明两条途径的相互作用至关重要。

本研究的冷冻电镜图揭示了激活 PafBC 的 ssDNA 跨两个 WYL 结构域的密度，结构基础的突变实验也支持了这一发现。这为之前的体内生存实验提供了背景，解释了为何突变 PafB WYL 结构域会破坏 ssDNA 结合和 RNAP - PafBC 复合物形成，而突变 PafC WYL 结构域影响较小，表明 ssDNA 配体先与 PafB WYL 结构域结合。

PafBC 的 ssDNA 结合模式与已报道的另一种含 WYL 结构域转录因子 DriD 不同。DriD 是同二聚体，其两个 WYL 结构域各结合一个 ssDNA 分子，且结合方式与 PafBC 不同。这种差异可能与 PafBC 的异源二聚体性质有关，其 HTH 结构域的不对称取向对与 RNAP 全酶的相互作用很重要，WYL 结构域间 ssDNA 结合的差异可能促进了这种不对称性。此外，许多含 WYL 结构域的转录因子在无配体时可结合启动子 dsDNA，而 PafBC 需在 ssDNA 存在时才与结合启动子的 RNAP - σ^A形成复合物，这表明不同的 WYL 结构域蛋白转录调节机制可能因同 / 异源二聚体性质和配体结合类型而异。

与 PafBC 类似，Streptomyces coelicolor的转录起始复合物中 AfsR 通过类似 sigma 适应的机制从不完善的 - 35 区域起始转录，但 AfsR 缺乏 WYL 结构域且激活途径不同。这支持了转录激活的 sigma 适应现象在放线菌中更普遍，且可由不同信号触发的假设。

本研究的 PafBC 结构与之前报道的 AauPafBC 晶体结构不同。本结构中两个 HTH 结构域可分别与启动子 dsDNA 或 RNAP 全酶相互作用，而 AauPafBC 晶体结构中 HTH 结构域的定位使其无法同时与两者相互作用。连接子区域在 ssDNA 结合信号转导中可能起重要作用，结合的 ssDNA 稳定连接子构象，进而稳定 PafBC 的活性构象。目前尚不清楚晶体结构是否代表 PafBC 的唯一非活性构象，未来研究 PafBC 在有无 ssDNA 时的灵活性及激活机制的时间分辨分析，对揭示其构象动态变化至关重要。

生化实验表明，PafBC 在无 RNAP 全酶时不结合 PafBC 启动子 dsDNA，而 RNAP - σ^A可与多种 dsDNA 模板结合。PafBC 仅在 ssDNA 存在且 RNAP - σ^A结合到 PafBC 特异性启动子 DNA 时形成复合物，支持了 RNAP - σ^A扫描 DNA、在 PafBC 启动子处停顿，然后与被 ssDNA 激活的 PafBC 结合的模型。

综上所述，本研究揭示了 ssDNA 结合 WYL 结构域别构激活 PafBC 的机制，阐明了 DNA 损伤如何通过 sigma 适应转化为 PafBC 依赖的转录反应。

材料和方法

1. 蛋白质纯化：本研究中纯化和表达的蛋白质序列均来自M. smegmatis。Strep 标记的 WT PafBC 及其变体、WT PafBC（N 端有可被烟草蚀纹病毒蛋白酶切割的 His₆标签）、RNAP、SigA - RbpA、CarD 等蛋白质分别通过不同的表达载体和宿主细胞进行表达，经细胞裂解、核酸酶处理、亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等步骤进行纯化，最后浓缩、分装并储存于相应温度。
2. 蛋白质浓度和预期大小测定：通过 280 nm 吸光度测定蛋白质浓度，使用 ExPASy ProtParam 工具计算摩尔消光系数和预期蛋白质大小。
3. 体外转录实验：构建含M. smegmatis recA启动子区域及相关编码序列的 DNA 模板，经 PCR 扩增、酶切和纯化后用于实验。将 ssDNA、ssRNA、核苷酸第二信使等溶解后储存备用。体外转录反应在含多种成分的反应缓冲液中进行，包括 DFHBI - 1T、rNTPs、DNA 模板、RNAP、SigA - RbpA、CarD、PafBC 等，并添加 RNase 抑制剂和牛血清白蛋白。反应在 96 孔 PCR 板中进行，用定量 PCR 仪器测量荧光，每个反应至少重复三次。
4. EMSA 和 Native PAGE 分析：将未标记和 FAM 标记的寡核苷酸溶解后测定浓度并储存。制备含特定结构的 DNA 构建体并退火处理。进行 EMSAs 实验时，将 PafBC 或其变体与荧光标记的 ssDNA 或 dsDNA 在反应缓冲液中孵育，然后在特定条件下进行电泳，通过成像观察 DNA 条带。研究 RNAP - σ^A和 PafBC 复合物形成的 EMSAs 实验类似，但反应成分和条件有所不同，实验结束后可通过成像或考马斯亮蓝染色观察结果，每个实验至少重复三次。
5. 分析凝胶过滤实验测定 ssDNA 与 PafBC 的化学计量比：将不同浓度的 dT20 ssDNA 与恒定浓度的 PafBC 在反应缓冲液中孵育，然后通过凝胶过滤色谱柱分离，记录色谱图，计算峰面积，绘制峰面积增加量与 ssDNA:PafBC 摩尔比的关系图，通过线性回归曲线的截距确定化学计量比。
6. 多序列比对：收集多种放线菌的 PafB、PafC 氨基酸序列及C. crescentus的 DriD 序列，用 ClustalW 进行比对，Jalview 进行可视化。
7. 冷冻电镜样品制备和数据收集：将寡核苷酸溶解、浓度测定后储存。制备 PafBC 依赖的启动子 DNA，将 RNAP、SigA - RbpA、PafBC、ssDNA 和启动子 dsDNA 在反应缓冲液中混合孵育，然后进行甲醛交联、淬灭，再通过凝胶过滤纯化并浓缩。将样品滴加到处理后的 Quantifoil Cu 300 R2/2 孔碳网格上，进行孵育、 blotting 和 vitrification 处理，在 Titan Krios 透射电子显微镜上收集数据。最初制备含 CarD 的样品收集了一组数据，因 CarD 增加粒子异质性