Centrioles 生成具有不同生物物理特性的两种支架构建有丝分裂中心体：探索细胞奥秘的关键发现

本文聚焦有丝分裂中心体组装机制，发现果蝇 Spd - 2（人类 CEP192）从中心粒流出，招募 Polo 和 Aurora A 激酶，催化形成两种特性不同的有丝分裂 - PCM 支架（Polo 依赖的 Cnn 支架和 Aurora A 依赖的 TACC 支架），它们协同构建中心体，对理解细胞分裂意义重大。

　　### 引言
中心体作为无膜细胞器，在细胞分裂中扮演着极为关键的角色，它由中心粒招募外周物质（PCM）形成。PCM 包含数百种蛋白质，尽管其分子构成复杂，但在细胞进入和退出有丝分裂时，能迅速地进行组装和拆卸。这一特性引发了科学界对有丝分裂 PCM 生物物理性质的激烈讨论，尤其是液 - 液相分离（LLPS）在有丝分裂中心体组装中的作用备受关注。

在果蝇和线虫中，已提出了相对简单的有丝分裂 PCM 组装途径。其中，中心粒和 PCM 蛋白 Spd - 2/SPD - 2 发挥着核心作用，它能招募 Polo/PLK - 1，随后 Polo/PLK - 1 磷酸化 Cnn/SPD - 5，刺激形成可招募多种 PCM “客户端” 蛋白的大分子 “支架”。这一途径在多种物种中具有广泛的保守性，其同源蛋白在有丝分裂中心体组装中均有重要作用。

有趣的是，果蝇的 Cnn 支架呈现出类似固体的特性，而纯化的重组线虫 SPD - 5 在体外形成的凝聚物却具有瞬时的类似液体的性质。此外，在缺乏典型中心粒和中心体的小鼠卵母细胞纺锤体中，转化酸性卷曲螺旋蛋白 3（TACC3）能构建一个类似液体的纺锤体结构域（LISD），该结构域对减数分裂纺锤体的组装至关重要，且被认为是通过 LLPS 形成的。基于 TACC 蛋白在许多物种的有丝分裂中心体中都是重要组成部分，研究人员推测在正常有丝分裂纺锤体中，中心体可能会组织一个依赖 TACC 的类似 LISD 的支架。

结果

1. 果蝇 TACC 和 Cnn 形成具有不同生物物理特性的独立中心体支架：研究人员通过对比绿色荧光蛋白（GFP）标记的 TACC 和 Cnn 在早期果蝇胚胎中的中心体行为，发现二者存在显著差异。当用秋水仙素处理使微管解聚后，GFP - Cnn 凝聚成边缘不规则的异质支架，而 GFP - TACC 则形成边缘更平滑、结构更均匀的支架，且 TACC 结构延伸超出 Cnn 支架。进一步研究表明，TACC 支架可独立于 Cnn 支架形成，但 Cnn 支架能稳定 TACC 支架，防止其在中心体微管上分散。FRAP 分析显示，GFP - Cnn 荧光恢复缓慢，且主要在中心体中心区域恢复；而 GFP - TACC 荧光恢复更快，且在整个中心体区域均匀恢复，这表明 TACC 支架具有更类似液体的行为，分子能在其中更自由地移动和交换，而 Cnn 支架则表现出更类似固体的行为。
2. 中心体 TACC 支架与哺乳动物 LISD 相关：研究发现，TACC3、AURA 和网格蛋白重链 17（CHC17）对小鼠雌性减数分裂纺锤体中 LISD 的组装至关重要。在果蝇中，降低 Tacc、aurA 或 Chc 的基因剂量，会显著减小 TACC 支架的大小，而降低与中心体和中心粒组装相关但并非 LISD 组成部分的蛋白质（如 Pericentrin - 样蛋白（Plp）或 Plk4）的基因剂量则无此影响，这表明果蝇中心体 TACC 支架和小鼠 LISD 之间存在关联。此外，AurA 对 TACC 的磷酸化作用对 TACC 支架的组装至关重要，非磷酸化的 GFP - TACC - S863L 突变体虽仍能被招募到中心体，但无法形成正常的 TACC 支架，其在中心体的周转速度也更快。
3. Spd - 2 助力招募 AurA 和 Polo 至中心体：鉴于 AurA 磷酸化对 TACC 支架组装的关键作用，研究人员探究了 Spd - 2 在其中的作用。通过 AlphaFold2 - Multimer 预测，发现果蝇 Spd - 2_{229 - 310}与 AurA 的激酶域（AurA_{155 - 421}）存在高置信度的相互作用，涉及两个独立的界面。实验表明，删除 Spd - 2 的 AurA 结合域（ABD1 或 ABD2）会显著影响 AurA 向中心体的招募，其中 ABD2 在这一过程中起重要作用。同时，研究再次证实 Spd - 2 通过 Polo 的 Polo - Box 结构域（PBD）招募 Polo 至中心体，突变 Spd - 2 中所有潜在的 PBD 结合位点会强烈减少 Polo 的招募。值得注意的是，无法有效招募 AurA 或 Polo 的 Spd - 2 突变体在中心体的招募反而增加，推测这可能与 Spd - 2 招募这些激酶后更易离开中心体有关。
4. Spd - 2 分子在靠近中心粒处融入 PCM 并向外流动：在秋水仙素处理的 cnn^?/?胚胎中，同时表达 Spd - 2 - RFP 和 AurA - GFP，FRAP 分析显示二者动力学不同。Spd - 2 - RFP 荧光最初在中心粒处缓慢恢复，随后向外扩散；而 AurA - GFP 荧光在中心粒和 TACC 支架区域恢复更快。这表明 Spd - 2 分子只能在中心粒处融入支架并向外流动，而 AurA 可被中心粒周围和支架区域的 Spd - 2 分子招募。通过对单个 Spd - 2 分子的追踪实验发现，Spd - 2 - SNAP 分子平均在靠近中心粒处结合到 PCM（Spd - 2_In），而在远离中心粒处从 PCM 解离（Spd - 2_Out），从而直接证明了 Spd - 2 分子在果蝇胚胎中从中心粒向外流动。
5. TACC 支架浓缩中心体蛋白：为探究 TACC 支架是否能招募中心体 / 纺锤体蛋白，研究人员对比了多种荧光标记的中心体蛋白在野生型（WT）和 cnn^?/?胚胎中的中心体富集情况。结果发现，TACC 支架可独立于 Cnn 支架招募蛋白至中心体，且 Cnn 支架仅对部分 PCM - 客户端蛋白的招募起直接作用。对于无法有效组装 Cnn 支架的 Cnn 突变体，TACC 支架仍能使其富集，这表明 TACC 支架可促进 Cnn 支架组装的效率。利用荧光相关光谱（FCS）技术检测发现，TACC 支架能浓缩关键的中心粒和中心体蛋白，至少部分是通过减缓这些蛋白在支架内的扩散来实现的，因为这些蛋白可与 TACC 支架或支架内其他成分结合和解离。
6. 在合成珠表面重构有丝分裂 PCM 组装元件：基于有丝分裂中心体组装的 “核心” 途径，研究人员尝试用合成珠替代中心体来重构这一过程。将偶联了生物素化抗 GFP 纳米抗体的链霉亲和素磁珠与编码 GFP、GFP - Cnn、GFP - TACC 或 Spd - 2 - GFP 的 mRNA 一起注射到胚胎中。结果发现，只有 Spd - 2 - GFP 包被的珠子能招募 RFP - Cnn、mCherry - TACC 和微管（MTs），且 MTs 的动力学与内源性中心体同步。TACC 支架在合成珠表面能向外扩展，且其扩展不依赖于 Spd - 2 的流动，至少在一定程度上如此，同时也不受 MT 拉动力量的主要驱动。
7. Spd - 2 包被珠子上的 PCM 组装需要 Polo 和 AurA 的招募：为验证 Polo 和 AurA 的招募对 Spd - 2 包被珠子组织 Cnn/TACC 支架的必要性，研究人员将链霉亲和素磁珠偶联生物素化抗 ALFA 标签纳米抗体，并与编码野生型或各种突变型 ALFA 标签 Spd - 2 的 mRNA 共注射到胚胎中。结果显示，不能招募 Polo 的 Spd - 2?Polo - ALFA 珠子几乎不能招募 Polo - GFP 和 RFP - Cnn，但能招募 AurA - GFP 和 mCherry - TACC 并组织 MTs，不过其 TACC 支架的稳定性较差。而不能招募 AurA 的 Spd - 2?ABD1 和 Spd - 2?ABD2 珠子，对 AurA - GFP 和 RFP - TACC 的结合有强烈干扰，同时也影响了 Cnn、Polo 和 MTs 的招募。综合这些结果表明，Spd - 2 招募 Polo 和 AurA 的能力对驱动 Cnn 和 TACC 支架的组装至关重要，且两条途径在一定程度上可独立组织 PCM 和 MTs。

讨论

在脊椎动物中，中心体的 CEP192/Spd - 2 蛋白可招募并激活 PLK1/Polo 和 AURKA/AurA，在中心体和纺锤体极功能中起关键作用，但具体机制不明。在果蝇和线虫中，虽已知 Spd - 2/SPD - 2 招募 Polo/PLK - 1 促进 Cnn/SPD - 5 有丝分裂 PCM 支架的组装，但不确定其是否招募 AurA。本研究表明，果蝇 Spd - 2 确实招募 AurA，刺激形成第二个依赖 TACC 的有丝分裂 PCM 支架，说明 Spd - 2/CEP192 依赖的 Polo/PLK1 和 AurA/AURKA 向中心体的招募在人类和果蝇中是保守的，且驱动了围绕中心粒的两种有丝分裂 - PCM 支架的组装。

果蝇的中心体 TACC 支架与小鼠无中心体的卵母细胞减数分裂纺锤体中的 LISD 相似，二者的组装均依赖 AurA 对 TACC/TACC3 的磷酸化，以促进 TACC 与 CHC 的相互作用，且 CHC 对支架组装均有重要作用。LISD 最初被认为是无中心体的减数分裂纺锤体所特有的，而本研究表明，在有丝分裂纺锤体中，中心体是刺激 TACC 支架组装所必需的，因为中心粒可作为 Spd - 2/CEP192 的来源，这解释了为什么无中心体的有丝分裂纺锤体不组装 LISD。

有丝分裂 PCM 的生物物理性质，特别是 LLPS 在其组装中的作用存在激烈争论。果蝇中心粒生成具有类似液体性质的 AurA/TACC 支架这一发现，似乎支持 LLPS 假说，但不能确凿证明。因为在简单介质中纯化的蛋白质发生 LLPS，并不一定意味着在复杂的细胞环境中也会发生。而且，TACC 支架的组装似乎依赖 TACC 与 CHC 之间相对较强的立体特异性相互作用，这并非 LLPS 的典型特征。因此，Cnn 支架和 TACC 支架可能都更适合被描述为多孔粘弹性凝胶（尽管粘弹性性质不同），且都被细胞质渗透。

在果蝇胚胎中，两种支架对正确的中心体组装均不可或缺。Cnn 支架除了直接招募部分 PCM - 客户端蛋白外，还为 PCM 提供整体机械强度；而 TACC 支架的类似液体的性质使其能更易在中心粒周围扩展，形成更广泛的 “网络”，捕获中心粒和中心体蛋白，增加其在中心粒周围的局部浓度。

目前尚不清楚 TACC 蛋白是否在果蝇胚胎和小鼠卵母细胞之外的系统中形成支架，但 AurA 对 TACC 的磷酸化驱动其与 CHC 相互作用并组装支架的机制在人类和鸡的体细胞中也存在，这表明 TACC 支架可能在非卵母细胞 / 胚胎系统中组装。

本文提出的途径解释了为什么母中心粒通常是有丝分裂 PCM 组装的主要位点，因为它是 Spd - 2/CEP192 的来源。合成珠重构实验表明，仅在珠子表面浓缩 Cnn 或 TACC 不足以启动 PCM 组装，结合 Spd - 2 对激活 Polo 和 AurA 至关重要，进而磷酸化 Cnn 和 TACC 启动支架组装。因此，Spd - 2/CEP192、Polo/PLK1 和 AurA/AURKA 可能形成一个保守的核心机制，驱动大多数（如果不是全部）构建有丝分裂中心体的细胞类型和物种的中心体组装，但不同细胞类型和物种中，Polo/Cnn 和 AurA/TACC 支架的相对贡献、相互依赖程度以及它们招募的下游客户端可能有所不同。