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推荐阅读！本文通过研究果蝇幼虫脑发育过程中 RNA 结合蛋白 Imp（IGF2BP）和 Syp（SYNCRIP）的体内时间性 RNA 相互作用组，揭示其调控神经发育的组合网络，为理解神经命运特化提供了重要依据，极具科研价值。
引言
理解少量神经干细胞（NSCs）如何生成复杂大脑是发育生物学的关键问题，对生物医学意义重大，许多神经系统疾病源于神经发育异常。果蝇是研究脑发育的优秀模型，其神经发生与哺乳动物有诸多相似之处，且通过时间表达因子增加神经多样性的机制在果蝇中也保守存在。
在果蝇胚胎发育过程中，神经母细胞（NBs，果蝇 NSCs）的时间模式在胚胎腹神经索（VNC）中研究较为深入，级联的时间转录因子（TFs）产生依赖出生顺序的神经多样性。而在幼虫和蛹阶段，时间模式则由保守的 RNA 结合蛋白（RBPs）Imp/IGF2BP 和 Syncrip（Syp/SYNCRIP）的相反梯度调控，它们相互负调节。
Imp 和 Syp 的水平影响蘑菇体、运动神经元、中央复合体和视觉系统等的特化，还参与调节 NB 的静息退出、生长、自我更新、退役、突触传递和果蝇行为等过程。此外，它们的梯度特性允许整合外部信号到内在模式程序中。尽管已有研究对 Imp 和 Syp 的一些下游靶点进行了表征，但它们完整的 RNA 交互组及其时间变化仍未被探索。因此，识别受 Imp 和 Syp 靶向的转录本，对于理解神经命运模式的潜在下游效应至关重要。
结果
- Imp 和 Syp 在胚胎后脑发育中共享许多 RNA 靶标：为确定 Imp 和 Syp 在体内的 RNA 交互组，研究人员对果蝇幼虫组织采用 iCLIP2 技术，绘制了它们在转录组范围内的结合位点。实验选取了胚胎后发育的三个时间点：L1、L2 和 L3（幼虫孵化后 24、48 和 96 小时，ALH），代表 Imp 和 Syp 蛋白表达水平的不同阶段。通过主成分分析（PCA）验证了实验的可重复性，并且 iCLIP 读数主要映射到 3′非翻译区（3′UTR）或非编码 RNA（ncRNA），确认了免疫沉淀 RNA 片段的特异性。
研究发现 Imp 和 Syp 有大量重叠的靶标，且二者主要靶向蛋白质编码转录本，偏好 3′UTR。与人类和小鼠的相关研究对比，发现果蝇中 Imp 和 Syp 的 RNA 靶标在进化上具有一定的保守性。通过对幼虫脑单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）图谱的分析，发现 Imp 靶标在成熟神经元中表达较高，Syp 靶标在祖细胞中表达较高，但二者均结合神经元分化轨迹和神经胶质中的多种细胞类型标记基因，表明其在组织中的广泛活性。2. Imp 和 Syp 结合编码神经发育调节因子的 mRNA：基因本体（GO）分析显示，Imp 和 Syp 结合的转录本编码具有多种分子功能的蛋白质，在基因表达调控的转录和转录后水平的 TF/RBPs 以及细胞骨架调节因子方面显著富集。在神经发生相关的生物学过程中，二者的靶标也高度富集。
研究人员将实验数据集与全基因组 RNA 干扰（RNAi）筛选结果相交，发现 20% 的 RNAi 筛选基因是 Imp 或 Syp 的靶标，参与 NB 大小、数量、谱系长度或增殖缺陷的调节，说明 Imp 和 Syp 在 NB 谱系维持和分化中具有重要作用。此外，Imp 靶标在 “细胞生长” 和 “对胰岛素的反应” 等方面富集，且许多 NB 静息调节因子是 Imp 靶标，暗示 Imp 可能通过这些转录本影响 NB 重新激活。Syp 则与核糖体蛋白编码转录本结合，通过嘌呤霉素掺入实验证实 Syp 影响全局翻译水平。3. Imp 和 Syp 随时间动态结合编码时间因子的转录本：由于胚胎后神经发育程序受 Imp 和 Syp 相对水平的显著影响，研究人员基于 iCLIP 分数进行 k - 均值聚类分析，发现了六组在发育时间点上与 Imp 和 Syp 具有不同结合模式的基因。其中，Imp 靶标在 “更高 Imp 结合” 的聚类中富集，Syp 靶标在 “更高 Syp 结合” 的聚类中富集，但二者也存在共享靶标且结合水平不同。
进一步研究发现，已知的早期时间因子多在 “更高 Imp 结合” 组，晚期时间因子多在 “更高 Syp 结合” 组。在 NB 和神经元中，大部分受 Imp 或 Syp 靶向的时间表达基因表现出动态的 RBP 结合模式，且早期因子与 Imp 结合更强，晚期因子与 Syp 结合更强。在 NB 衍生的脑肿瘤中，也发现 Imp 和 Syp 的靶标与肿瘤细胞标记基因相关，表明这些靶标在肿瘤分化轨迹中可能被重新利用。4. Imp 和 Syp 转录后调节时间表达的转录本：通过分析 syp 基因敲除（syp KO）的 L3 脑 RNA 测序数据，研究人员发现 “更高 Syp 结合” 的转录本在 syp KO 脑中普遍下调，“更高 Imp 结合” 的基因则上调，说明 RBP 相对占有率比靶标状态更能预测调节趋势。
利用单分子荧光原位杂交（smFISH）技术，在 syp KO 的 L3 脑中研究发现，Imp 和 Syp 分别促进早期和晚期神经元标记物的表达，且这种调节作用在多个神经谱系中存在。例如，Syp 对晚期出生神经元标记物 jim 的 mRNA 稳定性至关重要，Imp 对早期出生神经元标记物 Ldh 的 mRNA 稳定性也有影响。此外，Imp 和 Syp 还能影响 mRNA 翻译，如 Syp 对晚期时间 TF Eip93F 的蛋白质合成输出具有特异性调节作用。同时，研究还发现 Imp 能使 syp 的 RNA 半衰期缩短，表明二者存在相互调节关系。5. Imp 与 Syp 之间的竞争性结合相互作用很少见：通过对 Imp 和 Syp 结合位点的基序富集分析，发现二者识别不同的 RNA 序列基序，Syp 结合位点富含 AU 基序，Imp 主要结合 CA 基序。在全局和单个基因水平上，二者的结合位点重叠程度较低，但在少数（<5%）转录本上有显著重叠，这些转录本多为时间调控基因。虽然在时间调控基因上 Imp 和 Syp 的结合位点重叠区域更长，但总体重叠程度仍较低，表明直接竞争结合不太可能是其全局调控模式。6. Imp 和 Syp 结合位点显示出共同进化和组合结合特征：计算 iCLIP 峰值的 phastCons 序列保守性得分发现，Imp 和 Syp 的结合区域比脑转录组更保守。通过互信息分析，研究人员发现 Imp 和 Syp 结合位点之间存在显著的共同进化联系，在共享 RNA 靶标的 5′UTR 和 3′UTR 中，有较高比例的靶标显示出二者结合位点对之间的平均互信息得分显著高于随机模拟的情况，表明它们可能通过组合相互作用来调控下游靶标。
讨论
本研究识别了 Imp 和 Syp 在转录组范围内的靶标，这两种 RBP 在胚胎后脑发育中具有最动态的时间表达梯度。研究 RBP 的 RNA 交互组对于理解其核心功能至关重要，因为它们通过调节靶标的 RNA 代谢来控制基因表达。本研究有助于理解转录和转录后机制如何共同塑造神经系统。
Imp 和 Syp 的相反时间梯度在多个胚胎后谱系中起模式作用，研究其靶标有助于理解神经元亚型身份的产生机制以及确保神经元类型正确比例的机制。此外，研究还发现 Imp 和 Syp 参与多种生物学功能，包括 NSC 生长、静息、能量代谢、信号传导、激素反应和肿瘤发生等。虽然已知它们在突触传递和细胞骨架重塑中的作用，但在电路连接性方面的发育背景尚不清楚，未来研究其在神经元精细投射中的调节功能将很有意义。
Imp 和 Syp 主要定位于细胞质，可能调节下游靶标转录本的稳定性、翻译和 / 或定位。二者 RNA 交互组的大量重叠表明它们可能影响大脑中更多基因的差异表达。虽然竞争性结合不太可能是主要的相互作用模式，但重叠区域仍可能是关键的调节枢纽。未来需要通过诱变研究来确定这些重叠结合位点对转录本响应 Imp 和 Syp 相反梯度的重要性。
另外，RBPs 也可以组合方式结合相同 RNA，本研究的结合位点共同进化分析支持 Imp 和 Syp 之间的这种组合相互作用。未来需要阐明 Imp 和 Syp 在大脑中的蛋白质相互作用伙伴，以及它们的组合结合如何影响这些因子的招募。哺乳动物中 Imp 和 Syp 的同源物在发育中的大脑中也表达并发挥重要作用，本研究发现无脊椎动物和脊椎动物中 Imp 和 Syp 的 RNA 靶标偏好和序列识别在进化上有一定程度的保守性，未来研究其下游同源时间因子在脊椎动物中枢神经系统发育中的作用将很有趣。
材料和方法
- 果蝇遗传学：所有果蝇品系在 25°C 标准玉米粉 - 琼脂培养基上饲养。实验使用多种基因型果蝇，包括野生型（Oregon - R）、Imp::GFSTF、Syp::GFP 等。对于 iCLIP 实验，同步化幼虫孵化阶段；对于 NB 克隆分析实验，利用热休克诱导的 flippase（hsflp）元件和 GAL4 flip - out 盒生成 GAL4 阳性 NB 克隆。
- 抗体：实验使用多种抗体，包括豚鼠抗 Syp、兔抗 Imp、豚鼠抗 Eip93F 等，用于免疫印迹（WB）、免疫沉淀（IP）、免疫荧光（IF）等实验，二抗则使用 Alexa Fluor 或 IRDye 标记的抗体。
- iCLIP 文库制备：根据不同样本类型（全幼虫、幼虫头部、幼虫脑）进行处理，样本经 UV - C 照射交联后裂解，裂解物经超声处理、离心过滤后进行蛋白质定量，再进行免疫沉淀。iCLIP 测序文库按照 iCLIP2 协议并结合多种修改方法生成，包括 RNA 部分酶切、免疫沉淀、RNA 末端修饰、接头连接、cDNA 合成和 PCR 扩增等步骤。同时制备大小匹配的输入文库（SMInput）作为对照背景。最终，对归一化和混合的文库进行测序。
- 生物信息学方法：对 iCLIP 原始 FASTQ 文件进行预处理，包括读段映射、PCR 重复过滤、交联位点提取和结合峰识别等步骤。RNA - seq 分析则使用 Kallisto - DESeq2 方法对公共 RNA - seq 数据集重新分析。利用 AUCell 方法测量 scRNA - seq 数据中 Imp 和 Syp 靶标的表达。通过多种 R 包进行功能注释和富集分析，比较不同物种 RBP 靶标，发现 RBP 结合序列基序，分析基因组区间相关性和共同进化等。
- 显微镜方法：RNA smFISH 实验中，组织经固定、通透、预杂交、杂交、洗涤等步骤后进行成像。smFISH 探针通过特定设计和标记合成。免疫荧光实验步骤与 smFISH 类似，在固定通透后进行封闭、一抗孵育、二抗孵育等操作。嘌呤霉素掺入实验用于检测蛋白质合成，通过免疫荧光观察掺入的嘌呤霉素。图像采集使用特定显微镜，采集后进行背景扣除、荧光强度量化、smFISH 图像量化和 RNA 半衰期计算等分析，统计分析使用 R 包 rstatix 进行。
致谢
感谢牛津大学 Micron 成像设施、A. Williams 以及众多提供果蝇品系、抗体和实验帮助的人员。研究得到了 Wellcome Trust、格拉斯哥大学、牛津大学等的资助。
