探秘阿斯加德古菌 ESCRT-III 系统：解锁膜重塑的进化密码

本文聚焦于内体分选转运复合体 III（ESCRT-III），通过研究阿斯加德古菌的 ESCRT-III 系统，揭示了其与真核生物相关蛋白的进化关系，以及该系统在膜重塑中的作用机制，为理解 ESCRT-III 依赖的膜重塑保守原则提供了关键线索。

　　

引言

细胞和真核细胞器的膜需进行重塑和修复，内体分选转运复合体 III（ESCRT-III）蛋白在其中发挥关键作用。在真核生物中，ESCRT-III 蛋白功能多样，参与细胞分裂、病毒出芽、内体多泡体形成等过程。真核生物基因组编码众多 ESCRT-III 同源物，通常分为八个亚家族，不同亚家族在不同细胞环境中发挥作用，且许多膜重塑事件需要多个 ESCRT-III 旁系同源物协同作用。单个 ESCRT-III 蛋白由简单的 α 螺旋构成，有 “开放” 和 “封闭” 两种构象，其聚合受膜结合影响，不同 ESCRT-III 亚基的顺序结合和聚合可重塑膜，但具体机制尚不清楚。本研究通过探究阿斯加德古菌的简化 ESCRT-III 系统，揭示其结构和生物物理特征，以及膜重塑的保守原则。

结果

1. 阿斯加德和真核生物 ESCRT-III 的进化：阿斯加德古菌是真核生物的近亲，其 ESCRT-III 系统极为精简，仅有两个同源物。通过系统发育分析发现，ESCRT-III 蛋白存在两个主要进化枝，分别包含阿斯加德 ESCRT-IIIA 和 ESCRT-IIIB 以及多个真核生物亚家族。这表明真核生物的 ESCRT-III 蛋白可能源于阿斯加德古菌祖先基因的复制和多样化。同时，根据真核生物亚家族在膜重塑中的招募顺序，推测阿斯加德 ESCRT-IIIB 先结合扁平膜，再招募 ESCRT-IIIA。
2. 阿斯加德 ESCRT-IIIB 原丝的结构：此前对 B 型 ESCRT-III 蛋白结构了解有限，本研究纯化了阿斯加德的重组全长 ESCRT-IIIB，发现其与含负电荷脂质的大单层囊泡（LUVs）混合后可形成长丝。通过冷冻电镜（cryo-EM）和相关技术解析其结构，发现该长丝由四个紧密相连的平行原丝组成，呈两对排列且有浅扭转。原丝中的单体采用开放构象，通过 α1 - α5 螺旋相互作用，原丝间通过 α1 和 α4 螺旋的静电相互作用结合，这种结构特征在古菌到真核生物中具有保守性。
3. 阿斯加德 ESCRT-IIIB 的膜结合动力学：LUVs 可触发 ESCRT-IIIB 自组装，通过总内反射荧光（TIRF）显微镜观察发现，当支持脂质双层（SLBs）中负电荷脂质 1,2 - 二油酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸 - L - 丝氨酸（DOPS）含量≥40 mol% 时，ESCRT-IIIB 能在膜上成核并生长。其聚合过程呈 S 形曲线，为两步动力学过程，与肌动蛋白等细胞骨架聚合物类似，且具有浓度依赖性。ESCRT-IIIB 可使巨型单层囊泡（GUVs）出现 “皱缩” 现象，且能结合不同曲率的膜，包括低曲率的 GUVs 和高曲率的膜纳米管（NTs），与真核生物 B 型蛋白不同，其聚合物结构灵活，能适应多种膜曲率。
4. 阿斯加德 ESCRT-IIIB 膜阵列的结构：为解析 ESCRT-IIIB 膜结合阵列的结构，研究人员采用特殊策略降低膜信号干扰，成功解析其结构。与非膜结合结构相比，膜结合原丝的亚基间距更小，α3 和 α4 螺旋间角度改变，表明 α3 - α4 环可作为铰链，增强原丝构象灵活性。ESCRT-IIIB 通过 α1 的 N 端和 α3 - α4 环与膜结合，该界面有正电荷和疏水残基，与其他真核生物 B 型和 A 型蛋白的膜结合界面相似。相邻膜结合原丝通过 α1 和 α4 螺旋的电荷互补相互作用，这种互补电荷有助于原丝间灵活结合。
5. ESCRT-IIIA 被 ESCRT-IIIB 招募到膜上：阿斯加德 ESCRT-IIIA 无法单独结合扁平膜，却能在无膜时形成不规则螺旋丝，且优先结合高曲率膜，如在 GUVs 的高度弯曲 NT 上自组装成簇。实验表明，ESCRT-IIIB 可招募 ESCRT-IIIA 到扁平膜上，两者同时添加时能协同结合并共聚合在膜上。当 ESCRT-IIIB 和 ESCRT-IIIA 与 LUVs 混合时，可产生不同膜曲率的结构，可能代表膜重塑过程中的不同阶段，显示出 ESCRT-III 聚合物组成的逐步变化可转化为细丝几何形状的改变和膜曲率的增加。

讨论

1. ESCRT-IIIB 的灵活性和膜相互作用：本研究首次详细解析了由全长亚基构建的 B 型聚合物结构，揭示了 ESCRT-IIIB 原丝通过 α3 - α4 铰链适应不同膜曲率的机制，其与膜结合和重塑的能力与真核生物 B 型 ESCRT-III 蛋白及部分 B 型 / A 型复合物相似。ESCRT-III 蛋白 N 端的疏水残基可能插入脂质双层，α1 螺旋的正电荷界面可作为第二个膜结合区域，两种结合模式的切换可能有助于膜重塑。
2. 阿斯加德 ESCRT-III 与膜的相互作用：虽然阿斯加德细胞膜的具体性质尚不清楚，但研究发现 ESCRT-IIIB 在重构膜上形成聚合物需要临界浓度，这可能与形成稳定的五亚基核有关。在细胞中，其他 ESCRT 成分在泛素化蛋白丰富的位点积累可能克服这一障碍。阿斯加德 ESCRT-IIIA 仅在 ESCRT-IIIB 存在时才被招募到扁平膜上，这与真核生物 B 型和 A 型 ESCRT-III 蛋白的作用类似，且两者同时添加时存在正反馈，可加速 ESCRT-III 膜涂层的形成。处理过两种蛋白的膜呈中间曲率，可能是膜向管转变的中间状态。
3. ESCRT-III 机制的进化：阿斯加德 ESCRT-IIIB 和 ESCRT-IIIA 构成了多组分 ESCRT-III 依赖的膜重塑的简单模型，表明这种两步膜重塑过程在真核生物起源前已在阿斯加德古菌中建立。尽管阿斯加德古菌中 ESCRT 蛋白的细胞生物学功能尚待确定，但根据其基因簇与真核生物多泡体机制相关成分的相似性，推测其可能通过产生细胞外囊泡清除多余或受损的泛素化膜蛋白。综合研究结果，提出 ESCRT-III 进化模型：所有 ESCRT-III 蛋白源于细菌和古菌最后共同祖先中执行膜修复 / 重塑功能的单一蛋白，该蛋白经演化产生了细菌中的 PspA/Vipp1 和古菌中的多亚基 ESCRT-III。在阿斯加德古菌和真核生物的共同祖先中，系统进一步演化出 B 型和 A 型 ESCRT-III 聚合物，真核生物起源过程中，基因组扩张使 ESCRT-III 系统更加复杂，亚基数量增加实现了功能专业化，但仍遵循保守的基本机制。

材料和方法

1. 系统发育分析：通过 HMMER 和 BlastP 搜索从 UniProt、GenBank 和 InterPro 数据库中检索真核生物和阿斯加德 ESCRT-III 序列，共获得 266 个真核生物（33 个生物体）和 81 个阿斯加德（39 个物种）的蛋白序列。使用 MAFFT 进行序列比对，IQTREE2 推断最大似然树，进行模型拟合和拓扑测试。
2. 基因克隆、蛋白质表达、纯化和化学标记：将编码阿斯加德 ESCRT-IIIA 和 ESCRT-IIIB 的基因克隆到 pET - 28a 载体，转化大肠杆菌 Rosetta DE3 (pLysS) 进行重组蛋白表达。通过亲和层析和尺寸排阻色谱纯化蛋白，去除 N 端标签后得到全长蛋白。对用于荧光显微镜实验的蛋白进行化学标记。
3. 分析型尺寸排阻色谱：使用 HiLoad 16/600 Superdex 200 尺寸排阻色谱柱，以标准蛋白建立校准曲线，对蛋白进行分析。
4. LUV 和纳米棒的制备以及膜上和膜外细丝的生成：按特定比例混合脂质制备 LUVs 和纳米棒（NTs），将蛋白与脂质透析形成细丝，用于后续实验。
5. 负染色电子显微镜：按标准协议制备负染色网格，在特定电子显微镜下收集数据。
6. 冷冻电镜样品制备和数据收集：将生成的 ESCRT-IIIB 细丝样品制备在特定网格上，进行冷冻固定，在不同显微镜下进行筛选和数据采集。
7. ESCRT-IIIB 细丝的冷冻电镜图像处理：使用 MotionCorr2 校正漂移，CTFFIND4 估计对比度传递函数（CTF）参数，通过多种软件和方法对细丝进行挑选、分类、建模和精修，最终得到高分辨率结构。
8. ESCRT-IIIB 细丝的模型构建和精修：利用 ModelAngelo 从头构建模型，在 Coot 中手动拼接和精修，结合 AlphaFold2 预测补充部分结构，在 Phenix 中进行聚合物精修和验证。
9. 膜结合阵列的冷冻电镜图像处理和模型构建：采用特殊方法处理膜结合 ESCRT-IIIB 阵列的图像，进行颗粒挑选、分类、重建和精修，利用已知模型进行拟合和分析。
10. 脂质覆盖的二氧化硅珠制备：混合脂质形成脂质膜，与二氧化硅珠混合干燥，用于制备 SLBs、GUVs 和膜 NTs。
11. SLB 膜制备和阿斯加德 ESCRT-III 蛋白招募的 TIRF 显微镜观察：制备 SLBs，将荧光标记的蛋白添加到流动室，通过 TIRF 显微镜观察蛋白招募过程，进行顺序添加和同时添加实验。
12. ESCRT-IIIB 聚合速率和最大表面覆盖率分析：从荧光曲线的线性区域斜率获取聚合速率，通过拟合实验数据得到最大表面覆盖率。
13. GUV 和 NT 实验：制备 GUVs 并从中拉出膜 NTs，添加荧光标记蛋白，使用特定显微镜进行观察和图像采集。
14. 阿斯加德 ESCRT-IIIB 在弯曲和扁平膜之间相对丰度的测量：提取蛋白在不同曲率膜区域的荧光信号并归一化，测量相对丰度。
15. ESCRT-III 诱导的膜结构特征的量化：测量 ESCRT-IIIA 细丝厚度、不同 ESCRT-III 细丝的相对取向和细丝间距，对膜结构特征进行量化。

致谢

研究团队感谢相关人员在实验技术、数据分析、讨论建议和计算资源等方面的支持，同时列出了研究的资金来源、作者贡献、利益冲突声明以及数据和材料的可用性信息。