揭秘海洋沉积物中鞭毛藻孢囊休眠调控机制：代谢、自噬与激素的协同作用

这篇研究利用 DinoSL 和 SMRT 测序技术，分析了海洋沉积物中鞭毛藻孢囊的元转录组。发现除光合作用外，多数代谢和调控通路活跃，自噬（Autophagy）和植物激素脱落酸（ABA）/ 赤霉素（GA）在孢囊休眠和萌发中起关键作用，为揭示其休眠调控机制奠定基础。

　　

引言

鞭毛藻在海洋生态系统中地位重要，既是海洋食物网、全球碳固定和氧气产生的关键参与者，也是珊瑚礁的重要光合内共生体，但部分鞭毛藻会产生毒素，引发有害藻华（HABs），对海洋生物和人类健康造成威胁。近年来，HABs 发生频率、强度等增加，以及全球变暖导致珊瑚白化，使得鞭毛藻的生物学和生态学备受关注。

许多生物在生命周期中存在休眠阶段，鞭毛藻的休眠阶段为休眠孢囊。休眠孢囊能在海洋沉积物中保持休眠长达 1.5 个世纪，在鞭毛藻生态，尤其是 HABs 形成过程中至关重要。它参与有性生殖创造遗传多样性，调节藻华的起始和终止，抵抗不利环境、病原体和捕食者的攻击，还可通过自然或人工媒介实现种群地理扩张。因此，海洋沉积物中休眠孢囊的丰度和分布可用于预测藻华的强度和范围。

尽管休眠孢囊意义重大，但由于缺乏原位测量工具和获取足够休眠孢囊的困难，其分子和生理过程几乎未被探索。此前对鞭毛藻的研究多基于单基因研究和单个物种的转录组分析，且实验室培养条件与实际海洋沉积物差异大。元转录组学技术可避免培养相关假象，而鞭毛藻特异性的 22-nt 长拼接前导序列（DinoSL）能作为 “钩子” 追踪鞭毛藻基因转录本。结合 DinoSL、单分子实时（SMRT）测序和元转录组分析，有望揭示鞭毛藻孢囊行为的分子和生理过程。本研究应用该综合方法，对从三个海洋沉积物样本中分离的休眠孢囊群体的基因表达模式进行研究，并以尖刺膝沟藻（Scrippsiella acuminata）为代表，深入探究鞭毛藻休眠孢囊的分子和生理过程。

结果

1. 获取大量沉积物埋藏休眠孢囊转录组：SMRT 转录组测序获得大量原始数据，经质量过滤和冗余处理后，得到 159,431 条高质量非冗余全长转录本（FLTs），即 “SMRT 基因”。功能注释显示，多数 SMRT 基因与已知基因匹配，且与鞭毛藻或微藻基因相似度高。三个样本库共有 3292 个 SMRT 基因，同一生态系统的两个胶州湾样本（JZB 和 JZBC）的孢囊组成更相似。
2. 元转录组涵盖多数主要代谢和调控通路：将 SMRT 基因映射到尖刺膝沟藻的转录组数据，发现休眠孢囊群体的元转录组涵盖除光合作用外的所有主要代谢和调控通路，包括碳水化合物、脂质、核苷酸、氨基酸代谢以及能量相关代谢等。同时，在基因转录、翻译、DNA 复制与修复、蛋白质折叠、分选和降解等关键调控通路中也高度富集。此外，还涉及细胞内运输和分解代谢、环境适应、减数分裂等相关基因。
3. 沉积物埋藏休眠孢囊中自噬转录活跃：从 SMRT 数据集中鉴定出 599 个参与自噬过程的 SMRT 基因，其中 193 个注释为自噬相关基因（ATGs），涵盖从酵母到人类保守的自噬核心机制。
4. 实验室诱导孢囊中自噬转录活跃得到证实：基于尖刺膝沟藻的转录组文库，获得 8 个 ATG 基因的全长 cDNA 序列。系统发育树分析表明，这些基因与元转录组中的 ATG 基因紧密聚类。qPCR 结果显示，在不同生长阶段的营养细胞和不同休眠期、不同储存温度的休眠孢囊中，8 个 ATG 基因在休眠孢囊中的转录水平显著高于营养细胞，且在 6 个月内呈现先升后降的趋势，4°C 黑暗储存的孢囊中基因表达下降更慢。
5. 荧光染色显示孢囊休眠期间自噬活跃：用荧光探针标记溶酶体 / 自噬溶酶体，通过观察蓝色荧光评估自噬活性。结果显示，尖刺膝沟藻休眠孢囊的自噬活性显著高于营养细胞，常规培养条件下，孢囊自噬活性随储存时间先升后降，4°C 黑暗储存时自噬活性较低且随时间逐渐下降。温度、休眠时间及两者的相互作用均显著影响孢囊的自噬活性。
6. 休眠孢囊群体中植物激素的生物合成、分解代谢和信号转导转录活跃：从海洋沉积物休眠孢囊群体的元转录组中鉴定出 947 个与九类植物激素生物合成、分解代谢和信号转导相关的 SMRT 基因，包括五大经典激素和其他四类激素。这些基因涵盖了激素合成和分解代谢关键步骤的编码基因。
7. 外源 ABA 和 GA 影响自然休眠孢囊萌发，GA 生物合成和分解代谢在深度休眠孢囊中活跃：添加不同剂量的 ABA、GA3 及其组合到海洋沉积物浓缩的休眠孢囊群体中，发现高浓度 ABA 抑制孢囊萌发，GA3 在一定浓度范围内促进萌发，两者具有拮抗作用。qPCR 结果显示，在尖刺膝沟藻孢囊形成和休眠期间，GA 生物合成相关基因（GA20ox和GA3ox）表达下调，GA 分解代谢相关基因（GA2ox）表达上调，且在 4°C 黑暗条件下这种趋势更明显。

讨论

1. 鞭毛藻休眠孢囊休眠期间广泛活跃代谢景观的转录证据：利用 DinoSL 和第三代测序技术，成功创建了沉积物埋藏鞭毛藻休眠孢囊群体的全长转录组数据集。此前鞭毛藻孢囊转录组多来自实验室诱导孢囊，而本研究中野外采集的三个休眠孢囊群体的代谢过程广泛。尽管鞭毛藻休眠孢囊代谢率低，但多数与主要代谢和调控通路相关的基因在转录水平上保持活跃，这与以往认为的 “休眠” 状态下基因应 “静止” 的观点相悖。推测可能存在一组 “活跃” 基因和通路维持孢囊活力和萌发能力，这可能是孢囊维持活力和节省能量的机制，通过维持必要转录本在低水平并增强 mRNA 稳定性来实现，但需进一步研究验证。
2. 自噬增强表明其为孢囊持续存在提供替代能量和细胞资源回收的关键策略：在鞭毛藻休眠孢囊中鉴定出多个 ATG 基因转录激活，通过 qPCR 和细胞器染色进一步证实了休眠孢囊中自噬活跃，且自噬强度在较高温度和孢囊形成后的前几个月增加。自噬是真核生物中高度保守的途径，在营养回收和细胞内稳态维持中起重要作用。此前在其他藻类中也发现自噬与营养限制响应有关，但在鞭毛藻休眠孢囊中研究较少。本研究表明自噬在维持鞭毛藻休眠孢囊活力和休眠中起重要作用，可能通过释放能量或回收大分子积累的中间成分实现。
3. 植物激素在维持休眠孢囊休眠中的潜在作用及 ABA 和 GA 的拮抗功能：虽然一些植物激素在藻类中已被发现，但其在藻类尤其是微藻中的功能尚不清楚。在陆地植物中，激素及其相互作用是调节种子休眠的重要内部因素，其中 ABA 和 GA 是主要的拮抗调节激素。鞭毛藻休眠孢囊与高等植物种子有许多相似之处，但对植物激素在鞭毛藻孢囊休眠中的功能研究仍处于起步阶段。本研究发现多种植物激素相关转录本，表明休眠孢囊的休眠受多种激素复杂相互作用网络调节。qPCR 检测显示，在孢囊休眠期间，GA 生物合成持续抑制，分解代谢增强，而 ABA 含量在孢囊形成和休眠期间保持较高水平，两者在转录水平上呈现拮抗调节。低温和黑暗环境下，GA 和 ABA 的生物合成和分解代谢受到相反影响。外源添加实验也证实了 GA 和 ABA 对孢囊休眠和萌发的拮抗作用。因此，推测 ABA 和 GA 是调节鞭毛藻休眠孢囊休眠的重要拮抗因子。

综上所述，本研究发现与 “休眠孢囊” 生理不活跃的直观概念相反，除光合作用外，多数参与主要代谢和调控通路的基因在野外采集的休眠孢囊群体中转录活跃。自噬在鞭毛藻休眠阶段活性显著更高，对释放能量和回收细胞资源至关重要。ABA 和 GA 在调节孢囊休眠和萌发中起拮抗作用，低温和黑暗环境影响它们的代谢，进而影响孢囊休眠深度。本研究结果为明确理解鞭毛藻休眠孢囊休眠的分子机制提供了重要基础，这一机制对鞭毛藻生态学和有害藻华研究具有重要意义。

材料和方法

1. 尖刺膝沟藻营养细胞和新形成休眠孢囊的全长转录组 SMRT 测序：尖刺膝沟藻是全球常见的有毒物种，易形成休眠孢囊，常被用于鞭毛藻生活史研究。本研究利用 PacBio Sequel 平台对其营养细胞和新形成休眠孢囊进行 SMRT 测序，获得全长转录组数据（NCBI 登录号：PRJNA1127753），作为参考转录组提供背景信息。
2. 沉积物采集和休眠孢囊浓缩：从中国青岛胶州湾和天津沿海采集三个沉积物样本，采集后部分样本立即处理，部分样本在 4°C 黑暗保存后处理。采用钨酸钠密度梯度离心法浓缩休眠孢囊，每个样本制备三个生物学重复，浓缩后的孢囊用于总 RNA 提取。
3. 鞭毛藻特异性 e-cDNA 文库制备和 SMRT 测序：提取总 RNA 并去除基因组 DNA 后，根据修改后的协议制备鞭毛藻特异性 e-cDNA 文库。使用特定引物进行 PCR 扩增，然后进行大小分级和选择，构建 18 个 e-cDNA 文库，每个文库在 PacBio Sequel 平台上进行 SMRT 测序。
4. 元转录组数据处理和转录本功能注释：利用 SMRT Analysis Server 2.3.0 对 SMRT 测序原始数据进行过滤和聚类，得到全长非嵌合（FLNC）读数，再经聚类和抛光得到高质量一致性序列，去除冗余后进行功能注释。将元转录组数据映射到尖刺膝沟藻的转录组数据，并通过 BLAST 搜索公共数据库验证功能预测。
5. 尖刺膝沟藻的藻类培养及营养细胞和休眠孢囊的制备：常规培养尖刺膝沟藻 IOCAS-St-1 菌株，根据先前描述的方法制备不同生长阶段的营养细胞和休眠孢囊，用于基因克隆、qPCR 检测和荧光染色等实验。
6. 从尖刺膝沟藻中克隆 ATGs 和参与 GA 生物合成及分解代谢的基因：基于尖刺膝沟藻先前的转录组文库部分序列，使用特异性引物和 RACE 技术克隆 8 个 ATG 基因和 3 个参与 GA 生物合成或分解代谢的基因。对获得的 ATG 基因进行系统发育树分析。
7. 不同生命周期阶段靶向基因的转录谱实时 qPCR 分析：设计两组实验，一组涉及不同生命周期阶段的细胞，另一组涉及不同储存条件下的休眠孢囊。以泛素结合酶基因（UBC）为参考基因，利用 2^?△△Ct方法分析目标基因的相对表达水平，数据进行单因素方差分析和 Tukey 事后检验，P≤0.05 为有显著性差异。
8. 用传感器对溶酶体 / 自噬溶酶体进行荧光染色：用 LysoTracker 和 LysoSensor 探针标记活细胞和 / 或孢囊中的溶酶体 / 自噬溶酶体，根据酸性环境下探针发出蓝色荧光的原理，在倒置荧光显微镜下计数发出蓝色荧光的细胞 / 孢囊，计算阳性染色细胞 / 孢囊百分比（PPC%），数据进行双因素方差分析评估差异显著性。
9. 外源 ABA 和 GA 对海洋沉积物浓缩休眠孢囊群体萌发的影响：采集胶州湾沉积物样本，浓缩休眠孢囊后设计四组处理实验，包括单独添加 ABA、GA3，以及两者不同浓度组合。实验持续 20 天，在倒置显微镜下监测孢囊萌发，计算萌发率，数据进行双因素方差分析评估差异显著性。

致谢

感谢 F. Wang 在采样方面的帮助。本研究得到中国科学院海洋大科学研究中心关键部署项目（COMS2019Q09）、国家自然科学基金（42176207）和崂山实验室科技创新项目（LSKJ202203700）的支持。研究由 Y.Z.T.、Y.D.、H.Y. 和 C.Y. 构思和设计方法；F.L.、Z.H. 和 L.S. 进行调查；Z.C. 进行可视化；Y.D. 撰写初稿；S.L. 和 Y.Z.T. 进行审核和编辑。作者声明无利益冲突。SMRT 转录组序列、尖刺膝沟藻全长转录组序列以及相关基因序列已提交至 NCBI，所有数据可在正文或补充材料中获取。