人类天然 B 细胞识别大流行前流感病毒血凝素：揭示潜在免疫防线与免疫应答机制

本文研究了人类天然 B 细胞对高致病性禽流感（HPAI）H5Nx 病毒血凝素（HA）的反应。发现针对 HA “头部” 的 H5 特异性天然 B 细胞频率高于交叉反应 B 细胞，部分天然抗体可中和 H5N1。这有助于理解免疫应答，为应对潜在大流行病毒提供依据。

　　### 引言
流感病毒表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶的季节性抗原漂移及大流行性抗原转变，给持久的抗体介导免疫带来挑战，对公共卫生构成威胁。高致病性禽流感（HPAI）H5Nx 病毒在野生鸟类中广泛传播，虽目前无 H5Nx 人传人记录，但该病毒获得某些突变后可能具备人际传播能力，还可能通过基因重配产生新的大流行病毒。

HA 糖蛋白经宿主弗林蛋白酶样蛋白酶切割为 HA1 “头部” 和 HA2 茎部。体液免疫常针对 HA 头部，这种对高变 HA 表位的优先靶向被称为抗体免疫优势，受天然 B 细胞受体（BCR）特性影响。传统研究抗原特异性天然 B 细胞的方法存在局限性，本研究采用体外方法，对大流行前 H5 HA 特异性天然 B 细胞库进行表征。

结果

1. HA 特异性天然和记忆 B 细胞分析：使用重组 HA 探针和流式细胞术分选策略，从健康人外周血中分离出针对 H5 HA 头部和 H1/H5 交叉反应的天然 B 细胞。结果显示，H5 HA 头部特异性天然 B 细胞的频率约为 H1/H5 交叉反应天然 B 细胞的 2.3 倍。对 7 名供体的研究发现，H5 头部反应性类转换 IgB 细胞（swIg）的频率比 H1/H5 细胞低约 11 倍。从 4 名供体获得 88 对重链和轻链序列，这些序列基因多样，多数为完全种系序列。此外，交叉反应 H1/H5 天然序列中缺乏与靶向保守 HA 茎表位单克隆抗体（mAbs）相关的 IgG 重链可变（IGHV）基因。
2. 天然抗体结合广泛的 H5 HAs：从众多序列中选取部分克隆进行进一步表征，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）确认重组 mAbs 与初始分离探针的反应性，并评估其对不同 HPAI H5Nx 分支 HA 的结合广度。结果发现，约 95% 对 H5 VN04 有亲和力的 mAbs 也能识别 A/Indonesia/5/2005 H5 HA，部分 mAbs 能结合所有测试分支的 HA。同时，部分天然 mAbs 表现出多反应性。
3. 天然抗体结合 H5 HA 头部结构域的易损位点（VSs）：通过 ELISA 竞争实验和酵母展示进行抗原表位定位，发现分离的天然 mAbs 与针对 VS2、VS3 和 VS4 的 mAbs 竞争结合。例如，HD16_D07 与 VS3 特异性抗体竞争，HD16_D04 与 VS3 和 VS4 相关抗体竞争，HD15_F06 与 VS2 特异性抗体竞争。突变分析表明，HD15_F06 对某些 H5Nx 病毒变体的结合能力有限，而 HD16_D07 和 HD16_D04 的结合受相应位点突变影响。
4. 天然抗体与 H5 HA 复合物的结构表征：通过冷冻电镜（cryo-EM）确定 HD16_D04 与 H5 VN04 FLsE 复合物的结构，分辨率为 3.1?。结构显示，HD16_D04 与 HA 的结合通过重链和轻链接触，其表位与先前定义的 VS3 和 VS4 部分重叠，且结合位点在不同 H5 HA 菌株中高度保守。
5. 识别 H5 HA 头部结构域的天然抗体具有中和能力：使用基于流感报告病毒的测定法评估 mAbs 的中和效力，26 种种系 mAbs 中有 9 种（约 35%）在 100μg/ml 时具有可检测的中和能力。这些 mAbs 主要是 H5 头部特异性克隆，其 ELISA 结合亲和力与中和百分比相关，部分高亲和力头部结合 mAbs 具有一定的中和活性，表明人类天然库中的天然抗体可在种系水平中和 HPAI H5N1 病毒。

讨论

本研究直接探测了人类天然 B 细胞库对 HPAI H5 HA 的特异性，发现识别 HA 头部的天然 B 细胞受体（BCRs）频率较高。尽管 H5 HAs 基因变异大，但分离的天然 mAbs 能结合多种 H5 分支。免疫原性受 BCR 频率影响，本研究中 HA 头部特异性天然 B 细胞频率较高，可能有助于优先产生针对头部的抗体反应。

与小鼠研究结果不同，人类和小鼠在实验方法、BCR 特征等方面存在差异。HA 头部特异性 mAbs，尤其是针对受体结合位点（RBS）的 mAbs，即使结合亲和力低也能中和病毒，本研究中部分 H5 头部特异性天然 mAbs 具有中和能力，这种种系反应可作为对病原体的 “类先天” 快速反应。

研究也存在局限性，如分析的人类供体数量有限，供体免疫状态未知，无法排除免疫缺陷和免疫暴露史对天然 B 细胞库的影响，还需更多结构表征来精细定位抗原表位。总体而言，本研究表明天然库中的体液反应可结合和中和大流行前的 HPAI H5Nx 病毒，有助于理解人类天然库对潜在人畜共患病威胁的识别机制，推动基础 B 细胞生物学和抗体免疫优势的研究。

材料和方法

1. 研究设计：旨在分析人类针对流感 HA 的天然 B 细胞库，从 7 名人类供体的外周血中分离天然 B 细胞，对 BCRs 进行测序，并从 4 名供体中重组表达多种 IgGs 进行生化表征，各实验样本量在图注中注明。
2. 供体样本：从马萨诸塞州总医院（MGH）献血中心的 7 名献血者采集外周血单个核细胞（PBMCs）用于单细胞分选，供体签署同意书，实验经 MGH 机构生物安全委员会批准，于 2022 年 4 月和 5 月进行 B 细胞分离。
3. 重组 HA 抗原的表达和纯化：设计编码多种流感 HA 的全长可溶性胞外结构域（FLsE）和头部结构的质粒，经密码子优化合成后克隆到表达载体，在 Expi293F 细胞中瞬时表达，通过钴亲和树脂和尺寸排阻色谱进行纯化。
4. IgGs 和 Fabs 的表达和纯化：合成 IgG 和 Fab 基因，克隆到表达载体并测序确认，表达和纯化方法与 HA 类似，IgGs 用磷酸盐缓冲液（PBS）交换缓冲，Fabs 进一步纯化。
5. 酶联免疫吸附测定：通过 ELISA 检测血清和 mAbs 与 HA 抗原的反应性，包括测定 EC₅₀值、确定 H5 HA 结合广度和检测多反应性等，具体操作包括包被、封闭、孵育、洗涤、检测等步骤。
6. 竞争 ELISA：将检测抗体生物素化，进行竞争 ELISA 实验，通过与已知结构的 IgGs 竞争结合 H5 FLsE，计算结合损失百分比，评估竞争情况。
7. 探针生成：对 Avi-tagged 的 FLsE 和三聚体头部构建体进行生物素化，与荧光标记的链霉亲和素（SA）混合形成荧光抗原四聚体，用于标记和分选天然 B 细胞，同时对细胞进行多种抗体染色，通过流式细胞术分选特定的天然 B 细胞。
8. BCR 测序：对解冻的 B 细胞裂解物进行逆转录，使用优化的引物集通过聚合酶链反应（PCR）扩增重链和轻链序列，进行 Sanger 测序并分析。
9. H5N1 报告病毒的生成：构建编码荧光蛋白 tdKatushka2 的 H5N1 报告病毒，通过转染多种质粒到 HEK 293T 细胞，在特定细胞系中进行病毒的传代和收获。
10. H5N1 报告病毒的滴定和中和：在 MDCK-SIAT1-H5 细胞上滴定病毒，进行中和实验时，将病毒与抗体混合孵育后感染细胞，通过检测荧光确定感染细胞数量，计算中和率。
11. HAI 测定：对血清进行处理后，通过 HAI 实验检测血清对 H5N1 病毒的血凝抑制活性，包括血清稀释、病毒孵育、红细胞添加等步骤。
12. 酵母展示抗原表位定位：生成突变的酵母展示文库，通过多轮正负选择和测序，将 HA 突变映射到 H5 HA 结构上，分析抗体结合情况。
13. 冷冻电镜样本制备和数据收集：将重组 HA FLsE 与 HD16-D04 Fab 按比例混合，进行样本处理后在冷冻电镜下成像，收集大量图像数据。
14. 冷冻电镜数据处理：使用 cryoSPARC 软件对冷冻电镜数据进行处理，包括运动校正、CTF 估计、粒子挑选、分类和精修等步骤，最终获得高分辨率的重建结构。
15. 模型构建和精修：利用相关软件将 HA 和 Fab 模型手动对接和构建到冷冻电镜图中，添加 N - 连接聚糖并进行精修和验证。
16. 统计分析：使用配对 t 检验（双尾）对图 1（D 和 E）中的数据进行分析。

致谢

感谢相关实验室成员的讨论和技术支持，列出了资助本研究的项目和机构，声明了作者贡献、竞争利益以及数据和材料的可用性。