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在开发有效 HIV-1 疫苗的征程中，诱导广泛中和抗体（bnAbs）的免疫策略至关重要。Brown 等人利用基于电子显微镜的多克隆表位作图（EMPEM）技术，发现兔子和恒河猴经多次加强免疫后会产生抗免疫复合物（anti-IC）抗体，该发现或为未来疫苗设计提供思路。
引言
当前针对 HIV 的疫苗接种策略旨在通过高效启动特定 B 细胞、消除脱靶表位反应，以及用能引导与广泛中和抗体（bnAbs）相关的体细胞超突变模式的抗原持续加强免疫，来诱导针对 HIV 包膜（Env）特定表位的 bnAbs。许多旨在诱导 bnAbs 的疫苗开发工作采用了稳定的可溶性三聚体 Env，如 SOSIP 免疫原。
抗体（Ab）对 SOSIP 免疫原的反应已通过传统血清学方法和基于电子显微镜（EM）的多克隆表位作图（EMPEM）进行了广泛研究。这些研究表明，抗体主要靶向 Env 底部的非中和免疫优势新表位，随后是对其他表位（如 C3/V5 表位）以及新表位（如 N611 聚糖孔）的一些毒株特异性反应。研究还发现，识别 gp41 底部的一部分抗体可在体内诱导其解离为原体，这些底部抗体 - 原体免疫复合物会引发针对 Env 内部非中和表位的抗体反应。因此，EMPEM 为体内免疫复合物的形成及其对后续 B 细胞受体（BCR）结合和次级抗体诱导的影响提供了新的见解和结构理解。
在本研究中，研究人员描述了另一种现象，即重复接种 SOSIP 免疫原后引发的抗独特型和抗免疫复合物（anti-IC）抗体。抗体在 Fab 的可变区内有自身的表位，称为独特型。针对独特型的抗体被称为抗独特型抗体。免疫网络理论提出，这些抗独特型抗体形成了一个相互作用的独特型网络，始于对抗原产生反应的抗体（Ab1）。这些抗体诱导抗独特型抗体（Ab2）的产生，Ab2 又刺激抗（抗独特型）抗体（Ab3）的产生，依此类推。抗独特型抗体可分为三类：（i）Ab2α 抗体识别 Ab1 中不在抗原结合位点但属于可变区的独特型；（ii）Ab2β 抗体识别 Ab1 抗原结合位点内的独特型并模拟原始抗原表位；（iii）Ab2γ 抗体结合在 Ab1 抗原结合位点附近，但不完全重叠，仍会干扰抗原结合。
稳定的三聚体 HIV Env 免疫原已成为诱导中和抗体的有前景的疫苗平台，许多概念正在人体临床试验中进行测试。三聚体免疫原设计、测试和免疫反应表征的迭代循环对于该平台的进一步优化仍然至关重要。因此，EMPEM 在这一过程中发挥着越来越重要的作用。在本研究中，研究人员使用 EMPEM 来阐明重复免疫 Env 三聚体如何导致产生以前未被重视的 anti-IC 抗体。研究人员报告了在对重组 HIV Env SOSIP 免疫原的抗体反应进行多克隆表位作图时发现的六种 Ab2α 抗独特型抗体的结构。这些抗独特型抗体在兔子和恒河猴中均针对识别 SOSIP 免疫原可变表位的抗体产生。抗独特型抗体在加强免疫期间重复接触抗原后出现，主要识别由框架区（FRs）组成的独特型。
结果
- SOSIP 免疫原在兔子中引发抗 IC 抗体：对新西兰白兔进行负染 EMPEM（nsEMPEM），以评估 16055 SOSIP.v8.3 抗原的免疫原性。nsEMPEM 分析显示，兔子 r2463 的多克隆抗体（pAbs）靶向单一免疫复合物中 gp41 的底部新表位和相邻区域。由于这些抗体似乎相互接触，研究人员使用冷冻电镜（cryo-EMPEM）进行了更高分辨率的研究。
cryo-EMPEM 使用基于连续几轮三维（3D）分类的数据处理流程，通过在 pAbs 靶向的表位 - 抗原结合位界面周围放置球形掩码，分离出结构独特的高分辨率类别。在本研究中，使用围绕结合 HIV Env 的 pAb 和 anti-IC Ab 的表位 - 抗原结合位界面的球形掩码，通过计算分离出含有 anti-IC Ab 的粒子。经过几轮不同掩码的 3D 分类，得到了含有抗原、初级抗体和 anti-IC Ab 的免疫复合物的高分辨率图谱。
在 cryo-EMPEM 数据处理过程中，研究人员重建了一个分辨率为 3.3 ? 的图谱，其中包含靶向底部表位的 pAb 和结合 N625 聚糖的 pAb，两者的表位 - 抗原结合位界面解析良好。分析发现，这两种抗体沿着它们的 FRs 相互接触，但相互作用似乎有限，底部 pAb 的 HFR3 与 N625 pAb 的 LFR1 中的芳香族残基接触。
此外，从该数据集中，研究人员以 3.8 ? 的分辨率分离出了相同的底部 pAb 与靶向 N611 聚糖的 pAb 的相互作用。在这种相互作用中，底部 pAb 的 LFR1 与 N611 pAb 的 LFR2 进行最小限度的非特异性接触。使用这种特定的底部 pAb 作为支架似乎是 N611 聚糖靶向 pAb 的首选结合方式，因为它是数据处理过程中观察到的主要种类。研究人员还观察到一小部分粒子，其中包含上述相同的 N611 pAb，但与不同的底部 pAb 相互作用，该图谱的分辨率明显较低，这与更大的灵活性一致，这些抗体之间的接触可能导致复合物的更大稳定性。
对这两个例子的结构分析表明，从 16055 r2463 分离出的免疫复合物都不符合抗独特型抗体的定义，因为这些抗体的抗原结合位点与免疫原接触，而不是与相邻抗体上的独特型接触。然而，这些结构突出了免疫系统产生具有互补表面的抗体的能力，这些抗体可以紧密堆积在抗原表面。因此，研究人员将这种类型的抗体相互作用定义为 I 类 anti-IC 抗体。
先前的一项研究评估了三价或四价 SOSIP 抗原在同时或顺序递送时是否能够诱导 bnAbs。在单价对照组中，五只兔子用 B41 SOSIP.v4.1 免疫。用 W22 血清与 B41 抗原复合进行表位作图。nsEMPEM 分析显示，兔子 r1646 产生了一种抗独特型抗体，靶向由 B41 SOSIP 和靶向 N241 聚糖孔表位的 pAb 组成的免疫复合物。
对 B41 r1646 免疫复合物进行 cryo-EMPEM 处理，得到了分辨率为 5.8 ? 的图谱。由于 pAbs 的局部分辨率较低（5.0 - 5.5 ?），将 B41 SOSIP.v664 三聚体和参考 Fabs 的初始模型对接入重建的 cryo-EMPEM 图谱中，未进行优化。该分辨率足以确定互补决定区（CDRs）和 FRs。对接模型分析显示，抗原结合 pAb 使用 HCDR1、HCDR3 和 LCDR3 接触 B41 中包含 N241 聚糖和周围 C2 和 C3 区域的表位，并使用 HCDR2 和 HFR3 接触 N88 聚糖。抗独特型 pAb 的局部分辨率较低（5.5 - 6.0 ?），但可以看出抗独特型 pAb 使用 LCDR1 接触 N241 pAb 的 LFR1，还使用 LCDR3、HCDR3 和 HCDR2 接触 B41 抗原上的 N339 聚糖。与针对 16055 SOSIP 引发的 I 类 anti-IC 抗体不同，这种抗独特型抗体使用其 CDR 环结合由 N241 pAb 和 B41 SOSIP 组成的新表位。因此，研究人员将这种相互作用类型称为 II 类 anti-IC 抗体。
用嵌合 CH505/BG505 SOSIP.v8.1 抗原对兔子进行额外免疫。用 W26 血清与嵌合抗原复合进行表位作图。nsEMPEM 分析显示，兔子 r2474 产生了一种 II 类抗独特型抗体。对 CH505/BG505 r2474 免疫复合物进行 cryo-EMPEM 分析，得到了分辨率为 4.4 ? 的图谱。该免疫复合物包含两种抗体，一种靶向抗原上的 V1/V3 界面表位，另一种抗独特型抗体结合由 V1/V3 pAb 的 FRs 和抗原上的 N138 聚糖组成的表位。抗独特型抗体使用 LCDR3 和 HCDR3 接触 N138 聚糖，并使用 HCDR1 和 HCDR2 与 V1/V3 pAb 的 HFR2 和 HFR3 相互作用。
研究人员在许多与 anti-IC 抗体相同的类别中观察到第三种 pAb 结合在三聚体的 V2 顶点。大多数粒子都含有这三种 pAb，导致 SOSIP 抗原顶部的抗体密集堆积。最终重建的图谱显示 V2 顶点 pAb 有一些弥散的密度，但似乎这种额外的抗体不与 V1/V3 pAb 或 anti-IC 抗体接触，因此未进行建模。这些观察结果与先前存在的针对 Env 的抗体反应塑造随后的反应一致。
对 16055 SOSIP.v8.3 免疫研究中的另一只兔子进行 nsEMPEM 分析时，似乎也引发了不同类别的抗独特型抗体。对 16055 r2464 免疫复合物进行 cryo-EMPEM 分析，得到了分辨率为 3.3 ? 的图谱，两种 pAb 的表位 - 抗原结合位界面解析良好。原子模型分析显示有两种 pAb，一种靶向 16055 SOSIP 上的 V2 表位，另一种抗独特型抗体结合完全由 V2 pAb 重链 FRs 组成的表位。因此，研究人员将这种典型的 Ab2α 抗独特型抗体相互作用定义为 III 类 anti-IC 抗体。进一步分析发现，抗独特型抗体主要使用 LCDR3 和 HCDR2 在 V2 pAb 重链的 FR1 和 FR3 区域内进行多次浅接触。表位 - 抗原结合位界面中的许多接触似乎发生在 V2 Fab 的 FRs 中的芳香族残基与 anti-IC 抗体的 CDR 环之间，广泛的 π - π 堆积网络可能有助于抗体在该界面的结合和稳定。2. 恒河猴中 BG505 SOSIP 免疫可引发抗 IC 抗体：上述研究表明，在兔子中，几种不同的 HIV Env SOSIP 免疫原均可引发 anti-IC 抗体。在先前发表的一项研究中，研究人员分析了非人灵长类动物的抗体反应。在该研究中，六只恒河猴用 BG505 SOSIP.v5.2 N241/N289 免疫。用 W38 血清与 BG505 SOSIP 抗原复合进行表位作图实验。对 Rh.33203 的表位分析显示，有一种抗独特型抗体靶向由 BG505 SOSIP 和两种 pAb 组成的免疫复合物，其中一种 pAb 靶向 gp120 界面表位，另一种靶向 V5 环。
用 cryo-EMPEM 进一步分析，得到了该免疫复合物分辨率为 4.6 ? 的图谱，SOSIP - V5 pAb 和 SOSIP - gp120 界面 pAb 的表位 - 抗原结合位界面分辨率适中。为了提高这两种 pAb 的分辨率并更好地观察与抗原的接触，在数据处理过程中分离出 gp120 界面 pAb（3.8 ?）和 V5 pAb（4.0 ?）的单个模型，并在 Chimera 中组合，生成免疫复合物的起始模型。抗独特型抗体表位 - 抗原结合位界面的分辨率较低（6 - 6.5 ?），因此仅进行了少量优化。
BG505 Rh33203 模型包含三种 pAb，一种靶向 gp120 界面表位，第二种结合 V5 环表位，第三种抗独特型抗体结合跨越 gp120 界面和 V5 pAb 的表位，它似乎不与 SOSIP 抗原相互作用，研究人员将其称为 IV 类 anti-IC 抗体。由于抗 IC 抗体表位的分辨率较低，难以确定具体的接触，但抗 IC 抗体似乎使用 LCDR3、HCDR3 和 HFR2 接触 V5 pAb 的 LFR1，在 gp120 界面 pAb 表位处，抗 IC pAb 使用 HCDR1 接触 Fv - CH1连接处，并使用 HCDR2 接触 HFR3。据研究人员所知，这种抗独特型抗体结合由两种抗体组成的独特型的结合机制此前尚未被描述。3. 抗 IC 抗体在反复接触抗原后引发：为了确定在疫苗接种方案中 anti-IC 抗体何时被引发，研究人员使用在一系列不同时间点收集的血清样本进行 nsEMPEM。在 16055 SOSIP 和嵌合 CH505/BG505 SOSIP 免疫中，在研究开始时（W0）或第一次免疫后 2 周（W2）未观察到抗体反应。第二次免疫后（W6），两项研究中均出现了针对底部新表位的抗体。B41 SOSIP 免疫不仅在第一次免疫后（W4 和 W6）产生了针对底部的反应，还在这些时间点产生了针对 N611 聚糖孔的抗体。在这些早期时间点未观察到被 anti-IC 抗体识别的前体抗体。第三次免疫后（W22），anti-IC 抗体与针对其他表位的扩展抗体库一同出现。通过推断，预计前体抗体在这些时间点之间先于 anti-IC 抗体出现，只是研究人员没有血清进行分析。
研究发现，nsEMPEM 通常检测样本中最丰富和亲和力最高的 pAbs，因此，一些在 cryo-EMPEM（一种更敏感的技术）中观察到的反应在纵向 nsEMPEM 中未被观察到。在这种分辨率下，区分 gp41 - 聚糖孔、N611 和 N625 表位可能具有挑战性，因此，研究人员在 16055 r2463 数据中无法观察到 N611 抗体。此外，研究人员可能由于 nsEMPEM 数据集中收集的粒子数量较少，而无法在 16055 r2464 样本中观察到 anti-IC 抗体。
纵向 nsEMPEM 还使研究人员能够评估恒河猴对 BG505 SOSIP 免疫的 pAb 反应如何发展。第二次免疫后（W10），观察到针对底部和 N289 聚糖表位的抗体反应。第三次免疫后（W26），出现了可被抗独特型抗体识别的前体 V5 和 gp120 界面抗体。第四次免疫后（W38），抗独特型抗体出现。因此，数据表明，anti-IC 抗体在第二次或第三次加强免疫后反复接触抗原时被引发，此时初级抗体靶点已被引发并在血清中以可检测的水平循环。4. 抗 IC 抗体抗原结合位富含芳香族残基：虽然 EMPEM 是可视化 pAb 对抗原反应的强大工具，但缺乏可用的序列信息限制了对 anti-IC 抗体之间特定表位 - 抗原结合位接触的解释。然而，III 类 16055 2464 anti-IC 抗体具有解析良好的表位 - 抗原结合位界面，使其成为使用 ModelAngelo 进行自动原子模型构建的有力候选对象。该工具结合了来自 cryo-EM 图谱、结构信息和预测的氨基酸概率的信息，客观地在未知序列区域构建原子模型。
使用 ModelAngelo，研究人员生成了 anti-IC 和 V2 pAbs 的预测序列，并使用它们搜索由外周血单个核细胞（PBMCs）生成的未配对 BCR 序列的下一代测序（NGS）数据库。研究人员能够识别出与 EM 图谱紧密匹配的 anti-IC 重链和轻链以及 V2 重链的序列。遗憾的是，预测的 V2 轻链在 BCR 库中未找到匹配项。研究人员将搜索范围扩大到观察到的抗体序列（OAS）和国际免疫遗传学信息系统（IMGT）中的兔子抗体序列，确定了一个种系序列（IGLV6S701 IGLJ501），该序列只需很少的突变就能很好地匹配 cryo-EM 密度。值得注意的是，研究人员进行的 NGS 测序未产生占兔子抗体库中轻链不到 1% 的 λ 链，由于这些限制，研究人员未能成功产生与 cryo-EMPEM 结果匹配的单克隆抗体。
对重建的 EM 图谱的详细检查表明，anti-IC 抗体的 HCDR3 和 LCDR3 环富含芳香族残基，这可以从对应于芳香族侧链的密度得到证明。为了验证这一假设，研究人员进行了频率分析，以确定在这些环的特定位置出现芳香族残基的可能性。使用 NGS BCR 序列的比对，研究人员计算了氨基酸概率分布，并根据氨基酸性质（极性、电荷、疏水性和芳香性）确定了 anti-IC 抗体的序列基序。LCDR3 在第 93 和 94 位（IMGT 编号）含有两个芳香族残基，根据分析，芳香族氨基酸在这些位置出现的频率分别为 26% 和 70%，这两个残基都没有显示出苯丙氨酸（Phe）的显著氨基酸频率，表明它们可能是酪氨酸（Tyr）残基。Tyr94与 V2 重链上的第 82 位残基进行关键接触，表明该残基可能是保守的，对抗体结合至关重要。HCDR3 也在第 96 和 98 位含有两个芳香族残基，芳香族残基在这些位置出现的频率分别为 25% 和 55%，最可能的身份分别是 Tyr<
