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本文聚焦二羟基酸脱水酶（DHAD），它是植物支链氨基酸（BCAA）生物合成途径中的关键酶，也是商业除草剂开发的靶点。研究解析了真菌天然产物曲霉酸（AA）抑制 DHAD 的机制及 AstD 的自我抗性机制，为新型除草剂研发和抗除草剂作物构建提供了方向。
### 研究背景
在农业生产中，除草剂的使用极大地提高了作物产量，例如在 1964 - 1979 年期间，美国玉米和大豆的产量因商业除草剂的使用分别增加了 20% 和 62%。然而，自 20 世纪 40 年代中期除草剂被引入后，抗除草剂杂草开始出现。在过去的 40 年里，市场上很少有具有新作用模式的除草剂推出，并且除草剂的重复使用加剧了杂草的抗药性问题，这对人类的食物供应构成了威胁。比如，针对支链氨基酸（BCAA）生物合成途径中第一种常见酶乙酰乳酸合酶开发的约 56 种商业除草剂，对含有广泛存在的抗性突变的杂草均无效。因此，迫切需要开发具有新作用模式的除草剂。
此前研究发现，真菌倍半萜天然产物曲霉酸（AA）是植物二羟基酸脱水酶（DHAD）的亚微摩尔抑制剂，DHAD 是 BCAA 途径中的第三种常见酶。该发现源于基于抗性基因引导的基因组挖掘，利用了真菌和植物管家 DHAD 之间的强序列同一性、真菌产生抑制剂时需编码对抑制剂不敏感的自我抗性酶（SRE）且其基因与生物合成酶基因共定位可被生物信息学识别等特性。但此前缺乏 DHAD - AA 复合物结构，阻碍了对 AA 抑制 DHAD 机制的阐明及新型除草剂的设计。
材料和方法
- 菌株和培养条件：使用 Aspergillus terreus NIH 2624 在 28°C 的马铃薯葡萄糖肉汤培养基中静置培养 14 天，用于生产 AA 和提取基因组 DNA 或 mRNA；采用 Escherichia coli BL21 (DE3) 进行异源蛋白表达，在 37°C 用于克隆，16°C 用于蛋白表达，培养于溶原肉汤（LB）培养基。
- DNA 操作技术：严格按照制造商的方案进行所有 DNA 操作，使用 New England Biolabs 的 DNA 限制酶和 Q5 高保真 DNA 聚合酶进行聚合酶链反应（PCR）扩增，引物列于表 S1，通过 DNA 测序和限制酶消化检查验证 PCR 产物和质粒 DNA，使用 E. coli TOP10 进行克隆。
- 构建质粒：以 gBlock 模板通过 PCR 扩增 AthDHAD 基因的无内含子开放阅读框，并在 C 末端添加 6 - 组氨酸标签，将其整合到线性化 pET28a 载体中构建 pEUB1000 质粒；以 pEUB10001 为模板，使用特定引物进行 PCR 扩增引入氨基酸突变，测序确认突变。按照已发表方法构建用于表达 AthDHAD 及其突变体用于结晶的质粒，设计双突变 K559A/K560A 用于高效结晶。将 AstD 编码序列（残基 43 - 598）克隆到 pSJ2 载体中，在 N 末端添加 8 - 组氨酸（8xHis）标签和烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点。
- 大规模分离 AA：将 Aspergillus terreus 在 6 升马铃薯葡萄糖肉汤培养基中静置培养 14 天，过滤分离细胞和培养液。细胞用丙酮提取 3 次，培养液用乙酸乙酯提取 3 次，合并提取物得到粗提物油。粗提物先经正相硅胶柱纯化，再用反相 CombiFlash 系统进一步纯化，最后通过高效液相色谱（HPLC）纯化。
- 蛋白表达和纯化：用于体外测定的酶，将编码 AthDHAD 及其变体的质粒分别导入 E. coli BL21 (DE3)，在 LB 培养基中培养，诱导蛋白表达，添加 FeSO4，离心收集细胞，超声破碎，通过亲和层析纯化，用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白纯度，用 Bradford 蛋白测定法测定蛋白浓度。用于结晶的蛋白，将质粒 PDB1281 与编码 AthDHAD 的质粒共转化，诱导表达，离心收集细胞，在有氧条件下纯化，用烟草蚀纹病毒蛋白酶去除融合的组氨酸标签，浓缩蛋白。
- 蛋白结晶：在厌氧环境中，将浓度为 10mg/ml 的蛋白与储液按 1:1 比例混合，总体积 1μl，采用悬滴气相扩散法，在 16°C 下与 50μl 储液平衡结晶。AthDHAD 在结晶前与 AA 按 1:5 比例孵育。
- 数据收集和处理：所有晶体用含 25% 甘油的结晶溶液冷冻保护后在液氮中速冻。AthDHAD - AA 复合物数据在上海同步辐射装置（SSRF）的 19U1 光束线收集，AstD 数据集在 BL18U1 光束线收集，其他复合物数据在相应光束线收集。使用 XDS、HKL2000、HKL3000 等软件进行数据处理。
- 结构测定和精修：使用 Phenix 套件中的分子置换法 Phaser，以 holo - DHAD 结构为搜索模型解析结构，在 Coot 中构建模型，用 Phenix 套件的 phenix.refine 程序进行最终精修，用 Coot 验证模型几何结构，用 Pymol 软件绘图。
- 同源建模：使用 Visual Molecular Dynamics（VMD）将 holo - AthDHAD 与 apo - AstD 对齐，构建残基 191 - 241、[2Fe - 2S] 簇和 Mg2 +。
- 体外生物活性测定：在含 A10 缓冲液（不含 NaCl）的反应混合物中进行体外活性测定，计算米氏常数（kcat，KM）。用体外生化测定法测定 AA 对 AthDHADs 的抑制百分比，反应后用乙腈终止，添加苯肼衍生化产物，用 HPLC 分析，根据校准曲线计算产物浓度。
- 构建转基因植物：合成含 DHAD 变体和 2XFLAG - tag 的基因块，克隆到修饰的 pEG302 载体中，用泛素 - 10 启动子驱动表达，将构建体电转化到 Agrobacterium tumefaciens 菌株 Agl0 中，再转化到 A. thaliana rdr6 - 15 中，筛选阳性转基因植物并测试其在 AA 存在下的存活率。
- 蛋白质免疫印迹：研磨转基因植物叶片组织提取蛋白质，进行凝胶电泳分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上，用抗体检测，用 Amersham ECL Prime 检测试剂显色，用抗 FLAG M2 - 过氧化物酶抗体检测，用丽春红 S 染色总蛋白以显示上样量一致。
- AA 对拟南芥生长的抑制作用：用 70% 乙醇对 A. thaliana 种子消毒，播种在含乙醇对照或 100μM AA 的 Murashige 和 Skoog 培养基上，第 7 天拍照并测量鲜重。
- 统计分析：进行单因素方差分析，随后进行 Tukey 事后检验，应用 Scheffé 多重比较进行检验校正，显著性用不同字母表示，P 值和样本数（n）在图注中详细说明。
结果
- AthDHAD 和 AA 复合物的结构：通过在 E. coli 中共表达质粒 PDB1281 合成铁 - 硫簇，对 AthDHAD 进行纯化并与 AA 在厌氧箱中混合筛选结晶，用分子置换法解析复合物结构至 2.0? 分辨率。在 AthDHAD 和 AA 复合物的二聚体结构中，活性位点位于 N 末端结构域（残基 1 - 388）和 C 末端结构域（残基 394 - 573）之间的间隙，由 2Fe - 2S 簇和 Mg2 +形成。AA 通过极性和疏水相互作用填充整个底物口袋，其羧基和羟基与 Mg2 +配位，形成氢键网络，可能模拟天然底物的结合模式。
- AA 结合时活性位点的构象变化：AA 比天然底物大，其非极性区域与底物进入通道的残基有广泛疏水相互作用，导致活性腔扩张，相关残基发生位移和旋转，Mg2 +位置改变，配位残基侧链也发生变化，揭示了 AA 的强结合模式和自然界高效的生物合成逻辑。
- AstD 的晶体结构：AstD 与 AthDHAD 序列同一性高，催化相同反应但对 AA 完全不敏感。测定其 2.30? 晶体结构，发现 [2Fe - 2S] 簇、Mg2 +和残基 191 - 241 的电子密度缺失，通过同源建模补充该区域。AstD 与 AthDHAD 整体结构相似，但底物通道较窄，3 个氨基酸差异可能导致通道入口更狭窄，阻碍 AA 进入活性位点。
- AstD 的自我抗性机制：在 AthDHAD 中对 V496、V497、I177 和 V178 进行突变，测定突变体的动力学参数和对 AA 的抗性。结果表明，V496、V497、I177 和 V178 突变体对 AA 的抗性增加，但过大的突变会严重损害酶活性。通过解析部分突变体的晶体结构，发现突变导致底物通道入口变窄，阻碍 AA 进入活性位点。然而，基于 AthDHAD 和 AstD 结构比较的点突变，未能使 AthDHAD 对 AA 的抗性达到 AstD 的高水平。
讨论
分析 AthDHAD - AA 复合物的晶体结构，揭示了 AA 抑制的关键基团，为靶向 DHAD 的除草剂研发提供了重要参考。AstD 的自我抗性机制为培育抗性作物和创建新的杂草管理系统提供了潜力。对 AthDHAD 突变体的结构和动力学分析验证了活性位点入口周围较大疏水氨基酸增强对 AA 抗性的假设，但这些氨基酸不能完全解释 AstD 的高抗性，且抗性增加与酶活性降低相关。虽然点突变未达到 AstD 的高抗性水平，但为理解活性位点入口对酶活性和抗性的影响提供了见解。未来可能需要基于之前开发的酵母平台采用定向进化方法，进一步筛选，以全面了解有助于抗性的其他突变，AA 与 AstD 或 DHAD 突变体结合有望成为除草剂开发的有前景的先导。
