新型酶级联催化体系实现麻黄碱类生物碱的多样化生物合成

这篇研究报道了一种创新的2步酶级联（BsAlsS-IRG02）催化策略，成功突破了传统化学法在麻黄碱类生物碱（Ephedra-type alkaloids）N-位修饰的局限性。通过筛选枯草芽孢杆菌（B. subtilis）来源的乙酰乳酸合成酶（BsAlsS）实现芳香醛与丙酮酸的高效缩合（转化率>99%），并利用链霉菌（S. albidoflavus）的亚胺还原酶（IRG02）首次实现N-烯丙基、N-炔丙基和N-环丙基的生物催化修饰（转化率37%-84%），为开发新型拟交感神经药物提供了绿色合成路径。

　　

摘要

麻黄碱类生物碱作为具有重要药用价值的苯丙醇胺衍生物，其传统化学合成法存在毒性试剂依赖和步骤繁琐等问题。本研究开发了由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）乙酰乳酸合成酶（BsAlsS）和链霉菌（Streptomyces albidoflavus）亚胺还原酶（IRG02）构成的2步酶级联系统，成功实现16种苯乙酰甲醇（PAC）类α-羟基酮的合成（转化率>99%）及3种新型N-烷基化修饰（转化率37%-84%），为结构多样化的拟交感神经药物开发奠定基础。

材料与方法

研究采用大肠杆菌（E. coli）表达系统构建全细胞催化剂，通过分子对接分析BsAlsS与大肠杆菌乙酰羟酸合酶（EcIlvBN）的活性位点差异。使用Ni-NTA柱纯化蛋白，HPLC和质谱（MS/MS）分析产物。关键实验参数包括：30°C反应温度、100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）、0.1 mM硫胺素焦磷酸（ThDP）辅因子，以及20 g/L葡萄糖脱氢酶（BmGDH）辅酶再生系统。

结果与讨论

BsAlsS催化PAC类α-羟基酮的高效合成
分子对接显示BsAlsS活性口袋中Met⁴⁸³的氢键作用使其对4-羟基苯甲醛的催化距离（3.5 ?）优于EcIlvBN（4.2 ?）。实验证实BsAlsS在20 mM底物浓度下对16种芳香醛（含卤素、羟基和甲氧基修饰）均实现>99%转化，其中2,4-二甲氧基苯甲醛（1o）的转化率显著高于传统催化剂。全细胞催化与纯化酶活性对比显示，疏水性底物（如4-羟基苯甲醛）因膜渗透性差异导致转化率降低15%。

IRG02介导的N-烷基化修饰突破
筛选发现IRG02对炔丙胺（5）和环丙胺（6）的还原胺化活性最高（84%-91%），而AspRedAm^Q240A突变体仅对氨（3）有58%转化率。优化胺供体当量后，成功获得18种非天然麻黄碱衍生物，包括首次生物合成的N-炔丙基产物（5a-5f），其炔基可通过点击化学进一步功能化。

一锅法级联催化的挑战与优化
同步反应中IRG02对芳香醛的竞争性还原导致74%副产物，而分步策略（先BsAlsS催化4小时，后加胺供体）使N-环丙基产物（6a）转化率提升至59%。SDS-PAGE验证三酶（BsAlsS-IRG02-BmGDH）共表达成功，但产物抑制效应仍需工程化改造解决。

结论

该研究建立了首个生物催化N-烷基化修饰平台，拓展了麻黄碱类生物碱的结构多样性。未来通过定向进化优化酶活性（如提高IRG02对空间位阻底物的选择性）及开发多酶微反应器，可加速类四氢异喹啉（THIQ）等衍生药物的开发。这一绿色合成策略为替代高污染化学工艺提供了新范式。