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为解决大样本 3D 成像分辨率难题，研究人员开展 TESOS 技术研究。结果显示，该技术可实现大样本高分辨率成像，适用于多种显微镜系统。推荐阅读，一同了解其在生物结构研究中的创新突破与应用潜力。
摘要
将透明包埋与切片技术相结合，很可能是组织透明化和三维（3D）成像的未来发展方向。新发布的透明包埋溶剂系统（TESOS，Transparent Embedding Solvent System）可确保在整个样本中实现一致的亚微米分辨率成像，并且能够与不同的显微镜系统兼容。该方法在连接组图谱绘制方面展现出巨大潜力，可能是未来 3D 多重免疫荧光和 RNA 原位杂交成像的最佳选择。为了充分发挥透明包埋系统在大规模样本高分辨率成像中的潜力，还需要在标记、成像和数据处理策略等方面进行创新。
随着研究复杂生物结构需求的增长，三维光学成像受到了研究人员的极大关注。这项技术能够清晰呈现组织和器官的内部结构，有助于我们更好地理解解剖结构的复杂性，尤其是在神经系统研究中。三维成像对于无偏差地探索整个生物体以及哺乳动物的神经网络至关重要，是生物学研究的关键目标之一。
在大体积三维成像中，一个主要挑战是由于组织的不透明性，光线在组织深层会发生散射。组织透明化技术的发展是克服这一障碍、实现有效三维光学成像的重大突破。目前，主要有三种类型的组织透明化方法：疏水型、亲水型和基于水凝胶的组织透明化方法 [1-6]。尽管这些方法使用不同的化学试剂和策略，但它们的化学原理大致相似 [7,8]。通过去除磷酸钙、色素、脂质和水（疏水型方法）等成分，并使样本与成像介质的折射率相匹配，组织能够变得透明，适合使用光片显微镜或共聚焦显微镜进行成像。这使得在组织透明化处理后，能够对整个器官进行成像，包括啮齿动物和非人灵长类动物的大脑，甚至是整个啮齿动物。
然而，对于所有组织透明化方法来说，在整个样本中，尤其是像成年小鼠全身这样的大样本中，实现始终如一的高分辨率仍然是一个挑战。在样本的深层区域，信号强度和分辨率会显著下降 [9]。这是由于组织透明度不足、折射率匹配不完善 [10]，更重要的是现有成像技术的局限性。因此，以往的方法都无法在啮齿动物模型中完整地绘制出从外周神经系统（PNS）到中枢神经系统（CNS）的单个神经元投射图谱。
最近，Yi 等人在《Cell Research》杂志上介绍了一种名为透明包埋溶剂系统（TESOS）的新方法 [11]。该方法结合了组织透明化、透明包埋、切片和块面成像技术，以应对上述挑战，并能够对大样本进行一致的高分辨率成像。
在预处理后，样本被浸泡在含有苯甲酸苄酯和双酚 A 乙氧基化物二丙烯酸酯（Mn 468，两者都具有高折射率）以及紫外线（UV）交联引发剂的透明化溶液中。然后，将透明化后的样本和溶液暴露在紫外线下几分钟，这有助于形成具有良好机械强度的有机凝胶。固化装置和时间需要根据样本的类型和大小进行优化。对于小鼠脑样本，固化时间约为 5 分钟；对于较大的样本，如幼鼠或成年小鼠的躯干，则需要使用定制的玻璃腔室，使紫外线能够从各个角度照射。这个过程可以处理像成年小鼠全身这么大的样本，并且能够在 30 分钟内完成聚合。有机凝胶中的样本保持透明，并且处理后其内源荧光得以保留。
接下来，将样本固定在 MagMount 装置的上部。该装置的底板放置在显微镜下方的样本移动台上，而另一个底板则安装在旋转切片机上。使用共聚焦显微镜对样本进行成像，成像厚度与物镜的工作距离对齐。之后，将样本转移到切片机上，切除已成像切片的顶部 90%。然后将获取的所有图像堆栈拼接在一起，进行进一步的三维数据分析。对于成年小鼠的全身成像，两个通道产生了约 70TB 的数据。研究团队开发了定制的软件流程来实现自动体积拼接，使用文中提到的高性能计算（HPC）平台进行精确拼接大约需要 1 周时间。
TESOS 方法可以与不同的显微镜系统配合使用。研究团队通过将 TESOS 与光片显微镜相结合，成功地以均匀的微米体素分辨率对成年小鼠全身进行了成像。他们使用共聚焦显微镜对大组织样本实现了亚微米分辨率成像，并首次完整地绘制了从外周神经系统到中枢神经系统的单个感觉神经轴突的中尺度连接组图谱。
微尺度分辨率的三维成像对于绘制神经元连接图谱和理解细胞的分子特征至关重要 [12]。在当前的光学显微镜领域，成像分辨率、样本大小和成像成本之间存在着基本的权衡 [13]。高数值孔径（NA）的物镜能够提供高分辨率，但通常工作距离较短，限制了成像深度 [14]。一些研究报道了定制的物镜，将高 NA 与长工作距离相结合，用于对透明化样本进行成像，但这些物镜价格昂贵，并且需要特定的成像系统 [13,15-17]。此外，由于组织样本的透明度不足，微小的光学像差总是会发生，并在光路上累积，导致在深层区域不可避免地出现分辨率损失。透明包埋克服了上述挑战，在大样本中实现了均匀的高分辨率三维成像。通过将切片技术整合到组织透明化和三维成像过程中，研究人员可以轻松解决与光学物镜工作距离相关的限制。这使得无论工作距离和样本厚度如何，都能够选择商用物镜来获取高质量的图像。
TESOS 方法和像荧光显微光学切片断层成像（fMOST）这样的切片重建成像技术都将机械切片与光学成像相结合。然而，“透明” 这一特性使 TESOS 区别于 fMOST。TESOS 方法更像是块重建，最终的三维堆栈是由连续且重叠的图像块组装而成，而不是由切片组成。这种策略使其能够灵活地与各种成像系统兼容，包括光片显微镜 / 共聚焦显微镜 / 双光子显微镜。最近发布的 fMOST 系统，即阵列式 fMOST，通过将大脑直接包埋在琼脂糖中减少了样本制备时间，并且避免了组织透明化过程中可能出现的形态变化 [18]。但是，它需要自制的切片机和定制的成像系统。TESOS 则不需要专门的成像装置，这降低了普通实验室的操作成本。不过，仍然需要进行一些改进，包括 MagMount 装置。总的来说，这些方法的不同特点导致了它们适用于不同的场景。
空间转录组学和蛋白质组学的进展增加了对 3D 多重免疫荧光和 RNA 原位杂交及其 3D 检测的需求 [19,20]。传统上，这些技术用于薄片样本 [21]，将其扩展到整体样本存在两个主要困难：第一，与荧光团结合的大分子难以扩散到厚样本中，使得标记过程困难且耗时；第二，在三维成像过程中，由于透明度不足和折射率不匹配，深层区域的荧光信号可能会减弱或失真，干扰荧光共定位分析。当使用低 NA 的光学元件对透明化样本进行成像时，轴向分辨率的降低会导致不同 z 位置的荧光信号重叠，进一步影响共定位评估的准确性。
因此，使用高 NA 物镜一次对较薄的堆栈进行成像，是收集 3D 多重免疫荧光和 RNA 原位杂交数据的最佳方式。TESOS 方法及其三维成像流程可能是一个潜在的选择。通过使用高 NA 物镜，横向和轴向分辨率都得到了提高，从而提高了共定位评估的准确性。此外，透明包埋、成像和切片的过程确保了成像能够保持高质量和高分辨率，降低了由于深层区域荧光信号微弱或失真而导致结果误判的风险。
TESOS 方法在透明化和聚合后对内源荧光的保存效果令人满意。对于转基因荧光样本，无需额外的荧光染色来增强信号。可以使用线性通道解混方法从目标信号中减去自发荧光，以提高图像质量和信噪比。同时，TESOS 方法与病毒标记和免疫荧光染色兼容，这进一步拓宽了其应用范围，尤其是在灵长类样本研究中。然而，与其他组织透明化方法一样，免疫荧光染色中抗体穿透有限仍然是一个有待解决的挑战。vDISCO 使用纳米抗体对整个小鼠身体进行标记 [6]。Mai 等人最近报道了 wildDISCO，它能够实现标准抗体的深度均匀穿透 [22]。随机电转运技术已被证明能够快速分散抗体，并且相关设备已经商业化。未来，结合 TESOS 方法，开发尺寸更小的改进型荧光探针、创新促进膜透化的方法以及简化加速抗体扩散的装置，可能会进一步改善大样本的全组织荧光标记效果。另一方面，病毒标记是研究脑连接组和全身神经投射的常用方法。对于长距离投射，建议将含有 Cre 重组酶的高滴度腺相关病毒（AAV）载体，在特定启动子的驱动下注射到 cre 报告基因小鼠（如 Ai140）中，以在轴突内获得强烈的荧光蛋白表达。在 AAV 设计中，可以使用更亮的荧光蛋白，如 mScarlet，尤其适用于长距离或稀疏标记。
要理解器官的功能和功能障碍，需要详细解析其解剖结构和连接性。对于非人灵长类动物甚至人类组织的研究来说，这项任务更具挑战性。最近，成像技术和单细胞投射组图谱绘制技术的进展，极大地丰富了我们对神经回路组织原理的理解 [23,24]。新的全脑图谱绘制流程不断涌现，用于研究脑部疾病过程中的结构相互作用，同时尽量减少组织变形 [25]。然而，成像分辨率和速度仍有待进一步提高。随着对脑连接组图谱和全身投射图谱绘制需求的增加，为小样本单细胞分辨率成像设计的传统组织透明化方法必须进行变革。将透明包埋与切片技术相结合，很可能是组织透明化和 3D 成像的未来发展方向。未来，像 TESOS 这样的透明包埋系统可能的改进方向包括：（a）实现更高的透明度，以更好地与光片显微镜兼容；（b）提高凝胶强度，进一步减少组织变形并提高拼接精度；（c）实现自动化流程，降低人力成本。
为了充分利用创新的组织透明化和透明包埋技术在亚细胞水平获取结构数据的潜力，需要能够对大体积样本进行快速、高分辨率成像的显微镜。V 形光片装置对于对大而厚的透明包埋样本进行成像特别有效。此外，对于处理大规模数据的计算方法也有很大需求，包括多堆栈配准和拼接、三维渲染、交互式数据查看和分析以及大数据存储。随着成像和数据处理技术的不断进步，透明包埋方法将成为在神经科学和其他生物医学研究中实现均匀高分辨率成像的有力工具。
