双粒径 C 反应蛋白（CRP）抗体乳胶试剂的制备、特性研究及其在免疫比浊分析中的意义

本文聚焦 C 反应蛋白（CRP）检测，将 CRP 抗体偶联到两种不同粒径的乳胶微球上，优化反应体系。经实验验证，该双粒径乳胶试剂能提升检测准确性和灵敏度，为乳胶增强免疫比浊检测试剂发展提供重要方法框架，值得一读。

　　### 研究背景
C 反应蛋白（CRP）作为主要的急性期蛋白，在感染或组织损伤时，血浆中的 CRP 水平会迅速上升。它在先天免疫中发挥着激活补体、增强吞噬作用等关键作用 。同时，CRP 还是炎症的非特异性标志物，与心血管疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死等密切相关，是评估心血管疾病风险、诊断炎症性疾病以及判断患者预后的重要生物标志物。

乳胶增强免疫比浊法是一种基于抗原 - 抗体反应的免疫技术，以乳胶微球为标记物。该方法具有高灵敏度、操作简单、检测快速等优点，适合大规模临床检测。然而，乳胶微球的粒径对检测结果影响较大。大粒径乳胶微球虽能增强检测灵敏度，但会使背景信号复杂，在高浓度分析物检测时易出现信号饱和；小粒径乳胶微球背景信号低，但信号放大作用弱，灵敏度较低。因此，优化乳胶微球粒径比例和靶向分子亲和力，对提高检测的动态范围和检测限至关重要。

材料和方法

1. 实验材料：实验用到多种仪器，如济南微纳颗粒仪器有限公司的纳米粒度分析仪、日立公司的 HT7800 透射电子显微镜和 Hitachi 7100 全自动生化分析仪、岛津仪器有限公司的 Shimadzu 2800 紫外分光光度计等。试剂包括 1 - 乙基 -（3 - 二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC?HCl）、N - 羟基琥珀酰亚胺（NHS）、CRP 兔抗人多克隆抗体、CRP 鼠抗人单克隆抗体、CRP 抗原、聚苯乙烯乳胶微球等，分别购自不同公司。
2. 校准标准液制备：将浓度为 500mg/L 的 CRP 抗原用纯水稀释，制备成浓度为 0、5、10、25、50、100、150、250 和 350mg/L 的校准标准液。
3. 乳胶试剂的制备与优化
   • 制备偶联过程溶液：配制多种溶液，样本稀释液 R1、激活缓冲液、偶联缓冲液、封闭缓冲液和储存缓冲液，各溶液 pH 和成分不同，且均储存于 2 - 8℃。
   • 乳胶微球与 CRP 抗体的偶联：将激活缓冲液与大、小乳胶微球（80 - 280nm）按 1:1 比例混合，加入 EDC?HCl 和 NHS 溶液，37℃振荡孵育、离心后，将沉淀重悬于偶联缓冲液并超声处理，再加入 CRP 单克隆抗体孵育。之后加入封闭缓冲液孵育、离心，弃上清，将沉淀转移至储存缓冲液超声处理并在 37℃孵箱老化，得到 CRP 免疫乳胶溶液 A。用同样方法制备 CRP 免疫乳胶溶液 B，最后按预定比例混合 A 和 B 得到 CRP 免疫乳胶溶液 R2。
   • 紫外吸收法测定偶联效率：用紫外分光光度计测量空白偶联溶液在 280nm 处的吸光度（OD₀）、预偶联抗体与偶联溶液混合后的吸光度（OD₁）以及偶联后抗体和乳胶微球复合物离心后上清液的吸光度（OD₂），通过公式（OD₁ - OD₂）/OD₀×100% 计算偶联效率。
   • 反应系统的优化：设置生化分析仪的初始参数，样本先与稀释液（R1）孵育 5min，加入免疫乳胶溶液（R2）后测量吸光度（A₀），再孵育 5min 测量吸光度（A₁），根据吸光度差值（ΔA = A₁ - A₀）和反应曲线计算 CRP 浓度。
   • CRP 乳胶微球粒径的优化：根据临床诊断要求（线性检测范围至 350mg/L，检测限 0.1mg/L），在 100 - 280nm 范围内优化大乳胶微球粒径，80 - 145nm 范围内优化小乳胶微球粒径。以不同粒径乳胶微球为单一影响因素，与 CRP 抗体偶联制备免疫乳胶溶液，分别用 0 - 50mg/L 校准标准液检测大粒径乳胶微球偶联物对低浓度 CRP 样本的检测效果，用 50 - 350mg/L 校准标准液检测小粒径乳胶微球偶联物对高浓度 CRP 样本的检测效果，根据校准结果选择最佳粒径。
   • CRP 抗体与乳胶微球比例的优化：根据公式 S = 6/（πd）×C（S 为结合在乳胶微球表面的抗体量，π 为乳胶微球密度，d 为乳胶微球直径，C 为抗体在乳胶微球表面的结合常数）初步估算抗体用量，通过偶联效率评估抗体与乳胶微球的偶联效果。制备不同乳胶微球与 CRP 抗体比例（大乳胶微球：抗体为 10:0.5、10:1、10:1.5、10:2、10:2.5；小乳胶微球：抗体为 5:0.5、5:1、5:1.5、5:2、5:2.5）的 CRP 检测试剂，用已知浓度的 CRP 校准标准液测试，根据吸光度差值（ΔA）与 CRP 校准曲线、偶联效率和线性范围选择最佳比例。
   • 抗体与乳胶微球偶联条件的优化：以激活剂（EDC?HCl/NHS）浓度、偶联缓冲液 pH、封闭剂用量为正交实验因素，每个因素设 3 个水平，进行 4 因素 3 水平的正交实验，以偶联效率为标准确定抗体与乳胶微球的最佳偶联过程。
   
   

实验结果

1. 乳胶微球粒径的优化结果：大乳胶微球中，JSR - P0118（168nm）在 0 - 50mg/L CRP 浓度范围内，免疫乳胶试剂与校准标准的吸光度差值（ΔA）变化最大，线性关系最佳（R² = 0.9914），被选为最佳大乳胶微球；小乳胶微球中，JSR - P0014（80nm）在 50 - 350mg/L CRP 浓度范围内，ΔA 变化最大且线性关系最佳（R² = 0.9730），被选为最佳小乳胶微球。
2. 抗体与乳胶微球浓度比例的优化结果：对于大乳胶微球 JSR - P0118 和多克隆抗体，当多克隆抗体浓度低于 0.1875mg/ml 时，乳胶微球过量；浓度超过 0.1875mg/ml 达到饱和，偶联效率在抗体浓度增至 0.2500mg/ml 时趋于平稳。不同比例的免疫乳胶试剂检测校准物结果显示，大乳胶微球与多克隆抗体比例低于 10:1.5 时线性相关性强（R²>0.95），吸光度值增加可提高灵敏度，但比例进一步增加会降低线性度，因此确定最佳比例为 10:1.5。对于小乳胶微球 JSR - P0014 和单克隆抗体，当单克隆抗体浓度低于 0.6mg/ml 时，乳胶微球过量；浓度超过 0.6mg/ml 达到饱和，偶联效率在抗体浓度增至 0.8mg/ml 时趋于平稳。不同比例检测结果表明，小乳胶微球与单克隆抗体比例低于 5:1.5 时线性相关性强（R²>0.95），较高比例可扩大线性范围，但过高比例会使高浓度样本吸光度降低，确定最佳比例为 5:1.5。
3. 抗体与乳胶微球偶联条件的优化结果：通过正交实验设计筛选偶联条件，对于大乳胶微球，最佳组合为 A₂B₂C₂，即激活剂浓度 80mg/L、偶联缓冲液 pH7.5、封闭剂 4g/L，偶联效率为 92%；对于小乳胶微球，最佳组合为 A₁B₁C₂，即激活剂浓度 150mg/L、偶联缓冲液 pH7.0、封闭剂 15g/L，偶联效率为 91%。
4. CRP 免疫乳胶特性分析结果
   • 透射电子显微镜（TEM）表征：TEM 观察发现，未偶联的大、小乳胶微球分散性良好，无聚集现象。偶联 CRP 多克隆抗体后，大乳胶微球的形状和分布不变；偶联 CRP 单克隆抗体后，小乳胶微球的外观和排列也无明显变化，说明偶联过程未影响乳胶微球的物理性质和稳定性。混合不同粒径偶联抗体的乳胶微球后，免疫乳胶仍保持原有均匀分布。在与低浓度 CRP 反应时，大乳胶微球主要形成免疫复合物，小乳胶微球相对分散；与高浓度 CRP 反应时，小乳胶微球主要与抗原结合形成免疫复合物。
   • 纳米粒度分析表征：纳米粒度分析显示，大粒径乳胶微球偶联 CRP 多克隆抗体后，粒径从 168.24nm 增加到 173.51nm；小粒径乳胶微球偶联 CRP 单克隆抗体后，粒径从 80.41nm 增加到 87.97nm，表明抗体成功偶联到乳胶微球表面。不同乳胶微球的分散系数（PI 值）在 0.0278 - 0.0823 之间，说明单偶联抗体乳胶微球均匀稳定。按 1:8 比例混合后，平均粒径为 100.59nm（PI = 0.0823）。混合乳胶与抗原反应后，形成免疫复合物，粒径显著增加到 461.94nm（PI = 0.4087），表明反应后溶液中形成了更多复合物，系统均匀性和稳定性降低，该结果与 TEM 结果相互印证。
   
   

讨论

乳胶微球因易于制备、粒径分布均匀、灵敏度高，在生物分子定量分析和诊断中应用广泛。双粒径乳胶增强免疫比浊法检测 CRP 的关键在于免疫乳胶的制备，受多种因素影响，包括偶联缓冲液、激活剂和封闭剂用量、乳胶微球粒径以及抗体与乳胶微球的比例等。

在 CRP 与免疫乳胶微球的反应中，免疫反应强度与粒径呈负相关，大乳胶微球先聚集，小乳胶微球随后聚集。本研究选择 168nm 的 JSR - P0118 作为大粒径 CRP 乳胶微球，80nm 的 JSR - P0014 作为小粒径乳胶微球。优化结果表明，大乳胶微球在低 CRP 浓度样本检测中，回归曲线斜率更陡，提高了分析灵敏度；小乳胶微球在高 CRP 浓度样本检测中，吸光度随浓度增加而增加，改善了测量线性度。两者结合，实现了高灵敏度和宽线性范围的检测。

免疫反应性随粒径和电荷增加而降低。理论上，小乳胶微球比表面积大，需更多抗体标记；大乳胶微球比表面积小，所需抗体较少。本研究证实，大粒径 CRP 抗体浓度为 0.1875mg/ml、小粒径 CRP 抗体浓度为 0.6mg/ml 时，乳胶微球表面羧基与抗体反应达到饱和。小乳胶微球与 CRP 抗体的偶联比为 5:1.5，大乳胶微球与 CRP 抗体偶联比小于 10:1.5 时，抗原 - 抗体相互作用良好。

根据 Derjaguin - Landau - Verwey - Overbeek 理论，乳胶的稳定性受静电和空间排斥力影响。静电排斥力与乳胶颗粒表面电荷密度和水相电解质浓度（如 pH）密切相关，空间排斥力由部分水溶性低聚物或聚合物提供。研究表明，在固定电解质背景下，随着木瓜蛋白酶量增加，ζ 电位从负变正，稳定性曲线呈 U 型，电荷中和点稳定性最低，之后逐渐增加。因此，选择合适的激活剂、偶联缓冲液 pH 和封闭剂对抗体偶联和乳胶试剂的稳定性至关重要，不当的偶联条件可能导致胶体颗粒聚集沉淀。本研究系统评估了偶联条件，确定了大乳胶颗粒的最佳组合，有效增强了乳胶试剂的稳定性。

本研究对抗体偶联前后的乳胶微球以及它们与抗原形成免疫复合物的过程进行了表征。TEM 图像显示，抗体偶联前，乳胶微球粒径均匀、颗粒间距稳定、无聚集现象；偶联后，乳胶微球形态和分布无明显变化，不影响颗粒分散。电子显微镜清晰观察到乳胶微球与 CRP 反应后的聚集现象，形成免疫复合物。利用 Lambert - Beer 定律，将抗原 - 抗体相互作用量化为物理信号，可用于测定抗原浓度。TEM 图像还展示了不同 CRP 浓度样本与双粒径免疫乳胶微球混合后的聚集行为，与先前研究一致，进一步验证了 TEM 在表征免疫复合物物理相互作用和聚集动态方面的有效性。

纳米粒度分析结果证实了抗体成功固定在乳胶微球表面，且单偶联抗体乳胶微球均匀稳定。混合乳胶微球与 CRP 反应后，粒径和 PI 值显著变化，表明溶液中形成了更多复合物，与光电信号变化相关。纳米粒度分析结果与 TEM 结果相互印证，与先前研究结果相符。

结论

本研究证实了双粒径乳胶微球在 CRP 免疫检测中的有效应用。通过整合大、小乳胶微球，提升了检测能力，能够准确量化 CRP 水平。透射电子显微镜和纳米粒度分析验证了抗体的成功固定和免疫复合物的形成。这些研究结果为推进基于乳胶的免疫检测方法提供了有价值的见解，凸显了其在生物医学研究中有效检测生物分子的潜力。