高尔基恢复水疱补充延缓骨老化和授权老化骨再生

　　

细胞聚集体来源的细胞外囊泡：延缓骨衰老与促进骨再生的新希望

第四军医大学口腔颌面修复与再生国家重点实验室、国家口腔疾病临床研究中心等单位的研究人员 Peisheng Liu、Hao Guo、Xiaoyao Huang 等在《Bone Research》期刊上发表了题为 “Golgi-restored vesicular replenishment retards bone aging and empowers aging bone regeneration” 的论文。该研究揭示了衰老骨微环境影响间充质干细胞（MSC）功能和骨再生的机制，并且发现细胞聚集体来源的细胞外囊泡（CA-EVs）在延缓骨衰老和促进衰老骨再生方面的潜在治疗价值，为治疗年龄相关的骨质疏松症提供了新的思路和方法，对骨衰老相关疾病的研究和治疗具有重要意义。

一、研究背景

健康老龄化是人类和社会的共同目标，实现这一目标的关键之一是使衰老的驻留干细胞恢复活力，并增强衰老器官的再生能力。在骨骼系统中，年龄相关的骨质疏松症是老龄化国家常见的骨骼疾病，不仅危害人类健康，还增加了社会负担。骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为多能干细胞，在维持骨稳态和再生中起着关键作用。然而，随着年龄增长，BMSCs 的活力下降、分化方向改变，这是骨再生能力丧失和年龄相关骨质疏松症发展的重要原因。

目前，临床治疗年龄相关骨质疏松症和骨折的策略主要是饮食疗法辅以运动或局部物理治疗，这些方法较为保守；而以双膦酸盐和选择性雌激素受体调节剂为代表的抗吸收和合成代谢药物疗法，虽有一定效果，但长期使用会产生显著副作用。此外，针对 BMSCs 衰老的治疗方法鲜有报道，其潜在机制和分子靶点仍有待深入研究。

干细胞聚集体（CA）作为一种再生技术，可促进正常干细胞功能，但 CA 在衰老条件下的潜在再生价值尚未得到研究。细胞外囊泡（EVs）作为细胞间通讯的新兴信使，被认为是有前景的治疗剂。此前研究虽揭示了 CA-EVs 在促进组织 / 器官再生方面的作用，但 EVs 调节衰老 BMSC 衰老的精确机制，以及 CA-EVs 是否能延缓组织驻留干细胞衰老和预防年龄相关疾病仍不清楚。

二、研究材料与方法

（一）实验动物

选用 2 月龄和 18 月龄的雄性 C57BL/6J 小鼠，饲养于温度（24±2）°C、相对湿度（55±5）%、12 小时光照 / 黑暗循环的环境中，自由获取水和标准饲料。所有动物实验方案均经第四军医大学动物伦理委员会批准。

（二）细胞聚集体（CA）的构建与观察

将第 4 代人脱落乳牙干细胞（SHED）以/ 孔的密度接种于 6 孔培养板，细胞达到 90% 融合时，更换为细胞聚集体诱导培养基，在避光条件下培养，每 2 天换液，10 天后显微镜观察 CA 形成。对 CA 进行扫描电子显微镜（SEM）观察时，需依次进行固定、脱水、干燥等处理。

（三）CA-EVs 的分离、鉴定与应用

从 CA 的培养液中分离 CA-EVs，通过多次离心去除细胞和细胞碎片，获得 CA-EVs。利用纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测其颗粒数量，采用 BCA 法测定蛋白质含量并进行单细胞标准化。运用透射电子显微镜（TEM）观察形态，通过蛋白质免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达。在体外实验中，以 150μg/mL 的蛋白浓度将 CA-EVs 添加到 BMSCs 培养液中；在体内实验中，将 CA-EVs 用无菌 PBS 配制成 300μg/mL 的溶液，通过尾静脉注射，每周一次，每次 200μL（60μg），连续注射 6 周。

（四）统计分析

实验数据以均值 ± 标准差（Mean ± SD）表示，使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。两组比较采用 Student's t 检验，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Turkey's 事后检验，认为具有统计学意义。

三、研究技术路线

1. 探究衰老过程中 BMSCs 功能变化与机制：对比 18 月龄衰老小鼠和 2 月龄年轻小鼠的 BMSCs，通过 Micro-CT 分析骨结构，采用 CFU 实验、Ki67 免疫荧光染色、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红 S 染色等检测 BMSCs 的自我更新、增殖和分化能力，运用蛋白质组学分析筛选差异表达蛋白（DEPs），确定与高尔基体功能和囊泡运输相关的蛋白变化。

2. 研究衰老骨微环境对 BMSCs 的影响：收集年轻和衰老小鼠的骨髓上清液（Y/ABMS）处理培养的 BMSCs，通过 qRT-PCR 检测相关基因表达，进行 CFU 实验、EdU 染色、ALP 和茜素红 S 染色评估细胞功能，利用 TEM 观察高尔基体形态，通过 NTA 和 BCA 分析 EV 释放能力。

3. 评估衰老骨微环境对植入 MSC 聚集体的影响：构建骨髓移植（BMT）的骨缺损实验模型，将 CA 植入年轻和衰老小鼠的骨缺损部位，通过 TEM 观察 CA 中高尔基体结构，qRT-PCR 检测基因表达，Micro-CT 和组织学分析评估骨修复效果，RNA-seq 分析基因表达谱变化。

4. 分析 CA-EVs 的特性与功能：分离并鉴定 CA-EVs，进行蛋白质组学分析，通过 Western blot 和流式细胞术验证相关蛋白表达，研究 CA-EVs 对衰老 BMSCs 的作用，包括增殖、分化和高尔基体结构功能的影响，确定关键蛋白 STX5 的作用机制。

5. 验证 CA-EVs 在体内的治疗效果：建立 CA-EV 移植模型，通过局部递送 CA-EVs 治疗年轻和衰老小鼠的股骨缺损，利用 Micro-CT、组织学染色和免疫荧光染色评估骨再生效果；通过静脉输注 CA-EVs 治疗衰老小鼠，检测 BMSCs 功能和骨量变化。

四、研究结果

（一）高尔基体改变导致骨衰老中 BMSCs 功能下降

1. BMSCs 功能随年龄变化：与年轻小鼠相比，衰老小鼠的骨小梁体积分数（Tb.BV/TV）和皮质骨厚度（Ct.Th）显著降低。衰老 BMSCs 的自我更新能力受损，增殖能力下降，成骨功能减弱，脂肪形成能力增强，细胞衰老程度增加。

2. 衰老 BMSCs 的分子变化：对衰老和年轻 BMSCs 进行蛋白质组学分析，鉴定出 122 个差异表达蛋白。GO 富集分析显示，衰老 BMSCs 中显著下调的 DEPs 与高尔基体功能和囊泡运输密切相关。TEM 和 IF 染色表明，衰老 BMSCs 的高尔基体结构呈皱缩状态，功能相关蛋白表达下调，EV 释放量减少。

3. 高尔基体损伤对 BMSCs 功能的影响：用高尔基体破坏剂布雷菲德菌素 A（BFA）处理年轻 BMSCs，结果显示高尔基体结构破碎，BMSCs 的增殖和分化能力显著降低。RNA-seq 分析表明，高尔基体损伤影响了多个信号通路，PPI 分析揭示了相关分子靶点的复杂网络。

（二）衰老骨微环境通过受损的高尔基体诱导 BMSC 功能障碍

1. 衰老骨微环境对 BMSCs 的影响：用衰老小鼠的骨髓上清液（A-BMS）处理 BMSCs，qRT-PCR 分析显示，细胞周期相关基因（CDK 和 Cyclin 基因）表达下调，细胞衰老标记物 P21 和 P53 表达增加。CFU 实验和 EdU 染色表明 BMSCs 自我更新能力下降，ALP 和茜素红 S 染色显示成骨功能减弱，TEM 和 NTA、BCA 分析表明高尔基体结构改变，EV 释放能力受抑制。

2. 恢复高尔基体对 BMSCs 功能的影响：分离高尔基体组分处理衰老 BMSCs，TEM 和 GM130 IF 染色显示高尔基体结构恢复，BMSCs 的增殖和骨分化能力显著提高，相关蛋白表达恢复。

（三）衰老骨微环境破坏高尔基体并损害植入的 MSC 聚集体的再生能力

1. 衰老骨微环境对植入 CA 的影响：构建骨缺损模型并植入 CA，TEM 分析显示，植入衰老小鼠骨缺损部位的 CA 中高尔基体结构皱缩，qRT-PCR 分析表明细胞周期相关基因表达下调，衰老相关基因表达增加。Micro-CT 和组织学分析显示，CA 在年轻小鼠中能有效促进骨修复，在衰老小鼠中则效果不佳。

2. 衰老骨微环境对 CA 基因表达的影响：对植入不同环境的 CA 进行 RNA-seq 分析，结果显示衰老骨微环境抑制了与细胞分裂、EV 运输和释放相关基因的表达。体内实验进一步证实，衰老骨微环境抑制了植入 CA 的 EV 分泌能力。

（四）CA-EVs 的纳米级分析确定其再生和高尔基体调节特性

1. CA-EVs 的特性：成功分离并鉴定 CA-EVs，蛋白质组学分析表明，与 CA 相比，CA-EVs 中上调的 DEPs 显著富集于发育和再生相关的信号通路，且高尔基体功能相关蛋白表达增加。与单细胞 MSC 来源的 EVs（SCEVs）相比，CA-EVs 中与发育、再生、蛋白质运输和高尔基体组织相关的 DEPs 上调。

2. CA-EVs 的蛋白表达验证：Western blot 分析证实了 CA-EVs 中发育和再生相关信号蛋白以及高尔基体囊泡运输相关蛋白的表达。流式细胞术分析显示，CA-EVs 表面暴露多种高尔基体调节蛋白。

（五）CA-EV 治疗通过 STX5 恢复高尔基体稳态和 BMSC 功能

1. CA-EVs 对衰老 BMSCs 的影响：CA-EVs 能被衰老 BMSCs 吞噬，促进其增殖和骨分化，上调成骨蛋白表达。GM130 IF 染色和 TEM 分析显示，CA-EV 处理可恢复衰老 BMSCs 的高尔基体结构，促进高尔基体囊泡运输相关蛋白表达。

2. STX5 的作用机制：构建并测试针对 STX5 的小干扰 RNA（siRNAs），结果显示敲低 STX5 后，CA-EVs 对衰老 BMSCs 的高尔基体恢复和生物学功能促进作用显著减弱。

（六）CA-EV 移植促进衰老骨再生

建立 CA-EV 移植模型，局部递送 CA-EVs 到股骨缺损部位 48 小时后，发现 CA-EVs 可被驻留的 BMSCs 有效内化。28 天后，Micro-CT 分析和组织学染色显示，CA-EVs 能显著促进年轻和衰老小鼠股骨缺损处的骨再生。

（七）CA-EVs 增强衰老 BMSCs 功能并减轻年龄相关的骨丢失

通过静脉输注 CA-EVs 给 18 月龄衰老小鼠，6 周后，TEM 结果显示衰老 BMSCs 的高尔基体结构得到改善。功能实验表明，CA-EV 输注增强了衰老 BMSCs 的自我更新和骨分化能力，Micro-CT 分析显示衰老小鼠的骨量增加，组织学染色表明骨形成增强，骨吸收受到抑制。

五、研究结论与讨论

该研究发现衰老骨微环境会损害高尔基体，导致 BMSC 功能和再生能力下降。补充 CA-EVs 可通过暴露高尔基体调节蛋白 STX5 来挽救高尔基体功能障碍，增强衰老 BMSCs 的功能。体内给予 CA-EVs 能显著促进衰老小鼠的骨再生，改善骨量。这些结果揭示了高尔基体在干细胞衰老和骨衰老中的调节作用，表明 CA-EVs 在治疗年龄相关骨质疏松症和促进衰老骨再生方面具有潜在的治疗价值。

随着全球人口老龄化，年龄相关的骨疾病，如骨质疏松症，已成为日益严重的公共卫生问题。目前，骨衰老的精确发病机制尚不清楚，有效的治疗干预措施有限。本研究确定了衰老微环境中 BMSC 功能障碍的关键因素是 EV 合成和释放减少，这与高尔基体受损有关。同时，研究发现 CA-EVs 表达高尔基体功能蛋白，可恢复受损的高尔基体结构，增强衰老 BMSCs 的增殖和骨分化能力，从而改善骨衰老。然而，CA-EVs 延缓衰老的具体机制仍有待进一步阐明，CA-EVs 是否直接调节破骨细胞生成，还是通过减轻驻留 MSC 衰老间接发挥作用，也需要更多研究。

再生医学中，干细胞功能受周围微环境的严格调控。CA 模拟祖细胞凝聚，其细胞外基质为干细胞提供了有利的微环境，在组织再生中展现出潜力。EVs 作为细胞间通讯的重要介质，在治疗和药物递送方面受到广泛关注。本研究进一步表明，CA-EVs 不仅表达高尔基体调节蛋白，还能与高尔基体共定位，显著改善高尔基体结构和功能。未来研究可致力于提高 CA-EVs 的骨靶向性和利用率，深入探索其延缓衰老的详细分子机制。

高尔基体在细胞衰老过程中起着至关重要的作用。本研究发现衰老干细胞中高尔基体结构发生显著皱缩改变，伴随 EV 释放减少。化学性高尔基体破坏会导致 BMSCs 功能下降，而补充高尔基体则有助于恢复衰老 BMSCs 的功能。转录组分析表明高尔基体稳态调节 BMSCs 中的多个信号通路，但高尔基体受损影响 BMSCs 功能和衰老的具体机制仍需进一步研究。CA-EVs 处理衰老 BMSCs 可显著改善高尔基体结构，增强 EV 释放，揭示了膜信号相关的组装机制，其详细分子功能值得后续深入探索。

总之，该研究为骨衰老机制提供了新的见解，提出了以 CA-EVs 为基础的潜在治疗策略，为治疗年龄相关的骨疾病开辟了新方向，对推动再生医学在骨疾病治疗领域的发展具有重要意义。