线粒体转录延伸因子 TEFM 在 mtDNA 复制转录平衡中的关键作用 —— 九州大学研究解读

近期，九州大学医学科学研究生院临床化学与检验医学系等多个单位的研究人员，在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “TEFM facilitates transition from RNA synthesis to DNA synthesis at H-strand replication origin of mtDNA” 的论文。该研究首次利用人类杂交细胞系统构建了多个 TEFM 基因敲除（KO）细胞系，揭示了线粒体转录延伸因子（TEFM）在人类线粒体 DNA（mtDNA）复制过程中，于重链复制起点（）促进 RNA 合成向 DNA 合成转变的重要作用，为深入理解 mtDNA 的复制转录调控机制提供了关键依据，对探索线粒体相关疾病的发病机制及潜在治疗靶点意义重大。

一、研究背景

mtDNA 编码的基因对氧化磷酸化（OXPHOS）至关重要，其转录和复制过程紧密关联且精细调控。人类 mtDNA 为 16,569bp 的环状基因组，多数基因密集排列，仅约 1.1kb 的主要非编码区（NCR）包含复制和转录起始的顺式元件。mtDNA 转录从 NCR 多顺反子起始，轻链（L 链）和重链（H 链）各有其转录启动子（LSP 和 HSP）。转录起始时，线粒体 RNA 聚合酶 POLRMT 与转录起始因子 TFAM、TFB2M 形成线粒体转录起始复合物（mtTIC），随后转录延伸阶段 TEFM 与 POLRMT 结合赋予转录持续性。

mtDNA 复制存在两种机制：链异步复制（SAR）和链耦合复制（SCR）。SAR 中，H 链合成先于 L 链，H 链合成起始于，LSP 转录的 RNA 作为引物启动 H 链合成，同时还会合成 7S DNA 。尽管 7S DNA 发现已久，但其确切功能尚不明确。SCR 则具有与传统前导链和后随链耦合合成相似的特征。由于 L 链转录和 SAR 起始依赖于 LSP 的 RNA 合成，区域的 RNA - DNA 转换对平衡转录和复制意义重大，然而其分子调控机制却知之甚少。此前体外研究虽对 TEFM 在该过程中的作用有所探讨，但结果存在争议，且缺乏体内研究验证。

二、研究材料与方法

（一）细胞培养

选用 HeLa 杂交细胞、HeLa 细胞（缺乏 mtDNA）等进行培养，培养基为添加多种成分的杜氏改良 Eagle 培养基，部分实验在培养基中添加氯霉素以抑制线粒体翻译。实验所用细胞经 PCR 法检测无支原体污染，但未进行细胞鉴定。

（二）CRISPR/Cas9 基因编辑

针对人类 TEFM 基因外显子 2 设计 gRNA，合成寡核苷酸并克隆至 PX459 质粒，转染 HeLa 杂交细胞，经嘌呤霉素筛选和单细胞克隆，获得多个 TEFM KO 克隆。通过测序验证基因编辑效果。

（三）核酸及蛋白检测技术

转录水平检测：提取细胞总 RNA，经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转至尼龙膜，采用 Northern 杂交检测线粒体 rRNA、mRNA、tRNA 及 7S RNA 水平，部分 mtDNA 编码的 rRNA 和 mRNA 还通过逆转录 - 定量 PCR（qPCR）分析。
蛋白水平检测：总细胞裂解物经 SDS - PAGE 分离后转至 PVDF 膜，利用 Western blot 检测目标蛋白，使用特定抗体检测线粒体呼吸链复合物亚基、DNA 聚合酶 γ 亚基等。
核酸制备及分析：细胞裂解后经酚 - 氯仿抽提等步骤制备总核酸和线粒体核酸。mtDNA 拷贝数通过 qPCR 测定；7S DNA 经 PvuII 酶切后，用一维琼脂糖凝胶电泳和 Southern 杂交分析；mtDNA 复制中间体经 DraI 酶切后，通过二维琼脂糖凝胶电泳（2D - AGE）和 Southern 杂交分析。

（四）其他技术

构建表达 HA - 标记 TEFM 的细胞系，进行免疫共沉淀（Co - IP）实验检测 TEFM 与 POLG 的相互作用；利用免疫荧光成像观察蛋白定位；对实验数据进行统计学分析，以评估结果的显著性。

三、研究结果

（一）TEFM 敲除降低人类杂交细胞中 mtDNA 拷贝数

利用 CRISPR/Cas9 技术在 HeLa 杂交细胞中成功敲除 TEFM 基因，获得 6 个 TEFM KO 克隆。Western blot 检测显示，KO 克隆中 TEFM 表达缺失，而 mtTIC 组件 POLRMT、TFAM 和 TFB2M 表达未显著改变。qPCR 分析表明，所有 KO 克隆的 mtDNA 拷贝数均显著下降，平均拷贝数仅为亲本细胞的 55% 。这表明 TEFM 敲除影响 mtDNA 复制，但不影响线粒体转录起始的关键组件表达。

（二）缺乏 TEFM 时 7S DNA 水平和 SAR 中间体比例降低

对 7S DNA 和 mtDNA 复制中间体分析发现，与亲本细胞相比，TEFM KO 克隆中 7S DNA 水平相对于 mtDNA 严重降低，平均下降约 90% 。2D - AGE 分析显示，KO 细胞中 SAR 中间体与 SCR 中间体的比例下降。这表明在缺乏 TEFM 的活细胞中，区域的 RNA - DNA 转换下调，影响了 7S DNA 合成和 SAR 复制模式。

（三）TEFM 敲除增强转录起始频率

Northern 杂交分析线粒体转录本发现，TEFM KO 细胞中，靠近 HSP 和 LSP 编码的和水平升高，而远离启动子编码的部分 tRNA 水平降低。这表明 TEFM 敲除导致 POLRMT 延伸过程异常，提前终止转录，使得 POLRMT 加载到启动子元件的频率增加，进而增强了转录起始事件。

（四）TEFM KO 细胞中线粒体翻译产物耗尽

Western blot 检测显示，TEFM KO 克隆中 mtDNA 编码的 COXI 和 COXII（复合物 IV 亚基）水平严重降低，核 DNA 编码的复合物 I 和 III 亚基 NDUFB8 和 UQCRC1 水平也显著下降，而复合物 II 亚基 SDHA 水平在 KO 和亲本细胞中相当。这表明 TEFM KO 细胞线粒体翻译存在缺陷，导致 OXPHOS 相关蛋白合成减少。

（五）POLG 与 TEFM 共免疫沉淀

构建表达 TEFM - HA 的细胞系 T4 - 7R，进行 Co - IP 实验。结果显示，在 T4 - 7R 细胞洗脱液中检测到 POLG 的催化亚基 POLGα 和辅助亚基 POLGβ，尽管共沉淀效率较低（约 0.2 - 0.3%），但与阴性对照相比仍具有特异性。这表明 TEFM 可能与 POLG 相互作用，促进区域的 RNA - DNA 转换和 DNA 合成起始。

（六）氯霉素诱导的线粒体翻译抑制对转录和复制的影响

用氯霉素处理亲本 HeLa 杂交细胞 8 周模拟线粒体翻译缺陷。结果显示，处理后细胞中 COX I 和 COXII 表达受抑制，但 TEFM 和 TFAM 未被耗尽。与 TEFM KO 细胞不同，线粒体翻译抑制未降低 rRNA 和 mRNA 水平，和水平未升高，7S RNA 水平下降。此外，mtDNA 拷贝数和 7S DNA 水平下降，但幅度小于 TEFM KO 细胞，且复制中间体比例无明显变化。这表明线粒体翻译缺陷对区域 RNA - DNA 转换的影响与 TEFM 敲除不同，可能通过不同机制影响 mtDNA 代谢。

四、研究结论与讨论

本研究利用人类杂交细胞系首次构建多个 TEFM KO 细胞，证实了 TEFM 在人类细胞 mtDNA 复制中的重要作用。研究表明，TEFM 促进区域的 RNA - DNA 转换，可能通过与 POLG 相互作用促进 DNA 合成起始。TEFM 敲除导致 7S DNA 和 SAR 中间体减少、mtDNA 拷贝数降低，同时增强了转录起始频率。此外，TEFM KO 细胞中线粒体翻译缺陷，虽也影响 RNA - DNA 转换，但与 TEFM 缺失的直接影响不同，可能存在间接作用机制。

该研究结果与以往体外研究存在差异，可能是由于体外实验中 DNA 模板无法完全模拟线粒体核区环境，且缺乏关键的线粒体 DNA 解旋酶 Twinkle 。与其他相关研究相比，本研究首次在人类细胞中进行 TEFM 基因敲除研究，更具临床相关性，而此前小鼠模型研究与本研究在 7S RNA 水平及功能上存在差异，可能源于物种和细胞类型不同。总体而言，本研究表明 TEFM 是一种双功能线粒体蛋白，既作为 POLRMT 的延伸因子，又在复制起始中促进 RNA - DNA 转换，为深入理解 mtDNA 转录 - 复制平衡调控提供了重要依据。

然而，本研究存在一定局限性。未明确 TEFM - POLG 相互作用在 mtDNA 上的具体位置，由于 TEFM 在 mtDNA 上分布广泛，确定精确位置存在挑战。此外，未研究新发现的 LSP2 在 TEFM KO 细胞中对区域 DNA 合成和 L 链转录平衡的影响。未来研究可针对这些问题深入探索，进一步完善对 mtDNA 转录 - 复制调控网络的认识，为线粒体相关疾病的研究和治疗提供更坚实的理论基础。