单细胞转录组分析揭示大疱性类天疱疮的发病机制

单细胞分析显示，大疱性类天疱疮改变皮肤非免疫细胞和免疫细胞以及血液淋巴细胞的功能，将进展与NK细胞IFN-γ/AREG平衡联系起来，并提出了潜在的治疗靶点。

　　

单细胞转录组分析揭示大疱性类天疱疮发病机制的研究解读

中国医学科学院、北京协和医学院皮肤病研究所的研究人员在Communications Biology期刊上发表了题为 “Single cell transcriptome profiling reveals pathogenesis of bullous pemphigoid” 的论文。该研究通过单细胞转录组分析，深入探究大疱性类天疱疮（BP）的发病机制，为理解疾病进程、寻找潜在治疗靶点提供了关键依据，对推动 BP 临床治疗的发展具有重要意义。

一、研究背景

大疱性类天疱疮是一种常见的自身免疫性表皮下大疱性疾病，主要由针对半桥粒锚定蛋白 BP180 和 BP230 的自身抗体引发，这些抗体破坏基底角质形成细胞与基底膜之间的连接 。BP 通常发生于老年人，临床表现为剧烈瘙痒和大疱性皮损。越来越多的证据表明，BP 的影响具有全身性，其死亡率的增加与多种合并症相关，如血液系统异常、肿瘤、心血管疾病和神经系统疾病等。然而，BP 与这些并发症之间的内在联系尚不明确。

在 BP 的发病过程中，除了自身反应性抗体外，皮肤和血液中的多种细胞类型也发挥了重要作用。例如，Th2 细胞、2 型固有淋巴细胞（ILC2s）和嗜酸性粒细胞活性的增强，通过产生 IL-4、IL-5、IL-13 等细胞因子，促进水疱形成和瘙痒。调节性 T（Treg）细胞的缺失会导致 BP 小鼠模型中产生针对 BP230 的自身抗体。此外，嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞以及自然杀伤（NK）细胞等也参与了 BP 的疾病进展。但目前对于皮肤和外周血单个核细胞在 BP 发病机制中的具体作用，仍缺乏全面深入的了解。

在治疗方面，BP 治疗的首要目标是恢复病变皮肤的稳态和完整性，以减少病原体感染和炎症刺激引发的合并症。角质形成细胞和浸润免疫细胞的代谢与皮肤稳态密切相关，调节代谢途径对 BP 治疗具有潜在意义。同时，NK 细胞产生的双调蛋白（AREG）在维持上皮完整性方面发挥重要作用，但 AREG+NK 细胞在 BP 中的功能以及其与促炎 IFNγ+NK 细胞的相互作用尚不明确。因此，系统研究 BP 患者皮肤和血液中的细胞变化，对于揭示疾病发病机制、指导临床治疗至关重要。

二、研究材料与方法

（一）研究材料

研究使用了来自 BP 患者的非病变和病变皮肤样本，以及 BP 患者和健康对照者的外周血单个核细胞（PBMCs）。这些样本均取自中国医学科学院皮肤病研究所生物样本库和江苏省临床资源生物样本库（BM2015004），健康对照者的血液样本则来自江苏省血液中心。所有参与者均提供了书面知情同意书，研究遵循相关伦理规定。

（二）实验方法

1. 细胞分离与制备：使用全皮肤解离试剂盒，从 BP 患者的皮肤样本中分离出单细胞；通过密度梯度离心法，从人外周血白细胞层中分离 PBMCs。

2. 流式细胞术：对 PBMCs 进行染色，包括固定可存活染料、表面染色和细胞内染色，用于检测细胞表面标志物和细胞因子的表达，随后进行流式细胞术分析。

3. 单细胞 RNA 测序（scRNA - Seq）文库制备：采用 Chromium NextGEM Single Cell 5’ HT Kit v2 试剂盒，对皮肤细胞和 PBMCs 进行文库制备。将单细胞悬液加载到 Chromium Controller 上，将单细胞封装到凝胶珠乳液（GEMs）中，之后对扩增的 cDNA 和最终的测序文库进行质量评估，并使用 Illumina NovaSeq 6000 平台进行测序。

4. T 细胞受体（TCR）分析：运用 Cell Ranger 软件将 TCR - seq 读数与人类参考基因组（GRCh38）进行比对，以识别 T 细胞克隆型。筛选出高置信度、全长、有生产性的序列，并根据 TCR 对细胞进行克隆分类。

5. 基因集评分分析：运用 Seurat 中的 AddModuleScore 函数计算细胞簇的基因集分数，通过 Wilcoxon 秩和检验或双尾未配对 t 检验确定其显著性。

6. 伪时间分析：利用 Monocle 算法对 BP 皮肤 DC 亚群进行伪时间分析，聚焦于差异基因测试函数确定的前 400 个特征基因，以推断 DC 的分化轨迹。

7. 批量 RNA 测序（Bulk RNA - Seq）文库制备：采用 Trizol 试剂提取总 RNA，评估 RNA 完整性后，进行 mRNA 富集、片段化、逆转录、末端修复、加 A 尾、连接测序接头等操作，构建文库并使用 Illumina Novaseq6000 进行测序。

8. 数据分析：运用 Cell Ranger 和 Seurat 软件对 scRNA - Seq 数据进行处理和分析，包括数据过滤、整合、聚类等。使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析，通过 Mann - Whitney 检验、双尾配对或未配对 t 检验等方法，评估数据的显著性差异。

三、研究结果

（一）实验设计与单细胞分析概述

研究人员对 4 名未经治疗的 BP 患者的病变（L）和非病变（NL）皮肤细胞，以及 2 名处于活动期或缓解期的 BP 患者和 2 名健康供体的 PBMCs 进行单细胞转录组分析。通过 Cell Ranger 和 Seurat 软件进行数据处理，共识别出皮肤中的 95,257 个细胞和血液中的 33,921 个细胞。皮肤细胞形成 12 个簇，代表表皮非免疫细胞、真皮非免疫细胞和免疫细胞；PBMCs 主要形成 4 个簇，代表 T 细胞、B 细胞、NK 细胞和单核吞噬细胞。与健康人相比，BP 患者血液中单核细胞比例增加，淋巴细胞比例下降，表明循环免疫环境发生改变。

（二）BP 诱导的皮肤发病机制中非免疫细胞的协调反应

对 BP 患者的角质形成细胞（KCs）、成纤维细胞（FBs）、周细胞 / 肌成纤维细胞（PMs）和内皮细胞（ECs）进行重新聚类分析，发现不同细胞类型的簇对 BP 病理的反应存在差异。例如，分化的 KC2 与其他 KC 簇相比，独特的差异表达基因（DEgenes）较少；分泌网状和应激的 FB 比其他 FB 簇具有更多独特的 DEgenes。在病变皮肤中，毛囊相关细胞（HFACs）独特上调 WNT 信号通路和细胞周期调控相关基因，而分化的 KC1 中应激反应和氨基酸及脂质代谢相关基因则独特下调。不同皮肤非免疫细胞簇之间存在显著的共享转录变化，在病变皮肤中，这些细胞共同上调与炎症、增殖、伤口愈合相关的基因，如调节白细胞聚集、上皮细胞分化、生长、迁移和黏附的基因，同时下调与细胞凋亡和对钙的细胞反应相关的基因。基因集变异分析（GSVA）进一步表明，BP 病变皮肤中，细胞代谢、趋化性、免疫激活和细胞迁移相关的通路活性增加。

（三）BP 患者髓系细胞的特征

在 BP 患者的皮肤中，鉴定出 5 种巨噬细胞亚群和 5 种树突状细胞（DC）亚群；在血液中，鉴定出 CD14 单核细胞、CD16 单核细胞、cDC 和 pDC。与非病变皮肤相比，病变皮肤中 MARCO 巨噬细胞减少，其功能涉及 NK 细胞耐受诱导、中性粒细胞和巨噬细胞激活的负调节等多个方面。相反，病变皮肤中由常规 DC 成熟而来的 LAMP3+DCs 增加，其富集了与免疫调节、成熟、迁移和 Th2 反应相关的基因，且可能来源于 cDC1s 和 cDC2s。对 cDC1 和 cDC2 来源的 LAMP3+DCs 分析发现，cDC2 来源的 LAMP3+DCs 在 BP 病变皮肤中表现出更强的促炎特征。此外，BP 患者血液中的 pDCs 在活动期和缓解期均减少，且在缓解期仍维持促炎特征。在 BP 患者皮肤中鉴定出 4 个肥大细胞簇，病变皮肤中的肥大细胞上调与 IL - 2 信号、2 型炎症反应、TNF 信号等相关基因，而基质金属蛋白酶、AP - 1 家族成员和 IL1RL1 信号在非病变皮肤的肥大细胞中上调。TNF 和 VEGFA + 肥大细胞在病变皮肤中表现出更强的促炎特征，其中 VEGFA + 肥大细胞对 BP 进展具有关键作用。

（四）BP 相关的 B 细胞转录特征

皮肤 B 细胞较为罕见，血液 B 细胞分为幼稚 B 细胞、TBX21、IgM + 转换记忆（SM）和 SM 四个簇。BP 患者的 B 细胞共同上调与 NK 和 T 细胞相互作用、B 细胞激活负反馈和抗原呈递相关的基因。活动期 BP 患者的 B 细胞上调与分化、记忆和防止自身反应性相关的基因，同时下调与 1 型干扰素诱导相关的 IRF7；缓解期 B 细胞则独特上调 1 型干扰素信号通路基因，下调与 IL - 4 反应、IgM 产生和细胞代谢相关的基因。

（五）血液 LAG3 和 CX3CR1+ZNF683 + 耗竭 T 细胞代表 BP 反应性细胞

研究发现 Th1 细胞仅在血液中检测到，Th2 细胞仅在皮肤中存在，且 Th2 细胞在 BP 患者炎症皮肤中表现出较高的增殖活性。与 CD4+T 细胞不同，血液和皮肤 CD8+T 细胞簇（除血液中的幼稚 CD8+T 细胞外）均检测到扩增的 TCRs。血液中的 LAG3+B3GAT1、LAG3+B3GAT1 和 CX3CR1+ZNF683 耗竭 T 细胞在 BP 患者中比健康人具有更高的 TCR 扩增，且与皮肤 CD8+T 细胞共享更多克隆型。基因集分析显示，CX3CR1+ZNF683 + 和 LAG3 Tex 细胞在 BP 患者中具有更高的 TCR 活性和细胞毒性评分，且缓解期患者的 TCR 活性高于活动期患者和健康供体。

（六）NK 细胞活性与 BP 疾病进展相关

皮肤 NK 细胞主要由循环招募而来，在皮肤疾病进展和消退中起关键作用。研究将皮肤 NK 细胞分为 6 个不同簇，不同簇的 NK 细胞具有不同的功能特征，如 C0 NK 细胞具有高水平的炎症细胞因子，C2 NK 细胞具有高细胞毒性，C4 NK 细胞高表达 AREG。血液 NK 细胞主要分为 CD56dim NK 细胞和 CD56bright NK 细胞，也表达 AREG。在病变皮肤中，部分 NK 细胞簇的细胞毒性相关基因下调，干扰素刺激基因和 AREG 上调；在血液中，BP 患者 NK 细胞的整合素、细胞毒性相关基因和部分干扰素刺激基因上调，AREG 在活动期患者中下调，缓解期恢复。通过流式细胞术检测发现，活动期 BP 患者 NK 细胞的百分比和数量减少，缓解期恢复；AREG 产生增加，IFN - γ 产生减少。NK 细胞产生的 AREG 和 IFN - γ 与 BP 临床指标相关，AREG+NK 细胞与疾病严重程度呈负相关，AREG - IFN - γ+NK 细胞与疾病严重程度呈正相关。体外实验表明，AREG 可抵消 IFN - γ 诱导的角质形成细胞凋亡。

四、研究结论与讨论

该研究通过单细胞转录组分析，全面揭示了 BP 患者皮肤和血液中免疫细胞和非免疫细胞的功能变化，为理解 BP 发病机制提供了详细的细胞和分子层面的信息。研究发现皮肤非免疫细胞对 BP 诱导的损伤表现出协调反应，其基因表达在伤口愈合的不同阶段发生改变，靶向这些共享途径可能有助于促进皮肤损伤的愈合。例如，抑制糖酵解可能会影响伤口愈合，而维持氧化磷酸化的平衡，如通过补充维生素 C、E 等抗氧化剂，可能对 BP 患者有益。

在免疫细胞方面，研究揭示了多种细胞群体在 BP 中的变化。免疫抑制性 MARCO 巨噬细胞减少，而 LAMP3+DCs 和 VEGFA + 肥大细胞增加，这些变化可能促进了 Th2 反应和嗜酸性粒细胞的募集，加重皮肤炎症。血液中的 LAG3 + 和 CX3CR1+ZNF683 + 耗竭 T 细胞与皮肤 CD8+T 细胞共享高扩增的 TCRs，对其功能的深入研究可能为理解 T 细胞在 BP 发病机制中的作用提供新的视角。

此外，研究还发现 1 型干扰素信号通路在 BP 患者缓解期多个血细胞群体中上调，虽然 1 型干扰素与自身免疫性疾病易感性相关，但它也具有抗炎机制，其在 BP 疾病进展中的生物学意义仍需进一步研究。NK 细胞产生的 IFN - γ 和 AREG 在 BP 疾病进展中具有相反的作用，两者的平衡可能对 BP 发病机制至关重要。这一发现为开发针对 NK 细胞功能调节的治疗策略提供了理论依据，通过调节 NK 细胞中 IFN - γ 和 AREG 的平衡，可能成为治疗 BP 的新方向。

总之，该研究为 BP 的发病机制提供了新的见解，所确定的潜在治疗靶点为未来开发更有效的 BP 治疗方法奠定了基础，有望推动 BP 临床治疗的进一步发展。