新型 lncRNA LncMSTRG.11341.25：调控人骨髓干细胞成骨分化的关键因子及潜在治疗靶点

本文聚焦人骨髓干细胞（hBMSCs）在骨折愈合中的作用，探究新型 lncRNA LncMSTRG.11341.25（LncMSTRG25）对 hBMSCs 成骨分化的调控机制。研究发现 LncMSTRG25 通过 miR - 939 - 5p/PAX8 轴促进成骨分化，为骨折愈合治疗提供新理论依据，值得关注。

　　### 研究背景
在临床中，脾破裂合并肢体骨折较为常见，脾脏作为人体最大的免疫器官，在免疫调节中发挥关键作用。脾切除会导致免疫调节失衡，影响骨折愈合。此前研究发现，骨折合并脾破裂且接受脾切除的患者，骨折愈合延迟，炎症相关因子如白细胞介素 - 6（IL - 6）、肿瘤坏死因子 - α（TNF - α）和 IL - 1β 在急性骨折阶段显著降低，表明炎症反应在骨折愈合的特定阶段不可或缺。

干细胞具有多向分化能力，其中骨髓干细胞（BMSC）的分化对骨折愈合至关重要。长链非编码 RNA（lncRNA）可调节细胞分化，参与 BMSC 分化及骨生成，其作用机制主要通过微小 RNA（miRNA）“海绵” 效应影响下游基因表达。miRNA 在组织发育中发挥关键作用，可与靶基因 mRNA 的 3′非翻译区（3′UTR）结合，调控基因表达。研究表明，IL - 1β 对创伤性骨折愈合有促进作用，基于此，研究人员推测骨折合并脾切除后 IL - 1β 诱导的基因表达变化可能是人骨髓干细胞（hBMSCs）成骨分化的关键因素，进而展开相关研究。

研究方法

1. hBMSC 的提取与鉴定：从肢体长骨骨折患者的骨髓中分离 hBMSCs，在特定培养基中培养，使用 IL - 1β 诱导分化，通过流式细胞术对 hBMSCs 的表面标记 CD19、CD34、CD45、CD44、CD90 和 CD105 进行分选和鉴定。
2. 转染实验：设计并合成 miR - 939 - 5p 拮抗剂、模拟物、siRNA、siLncMSTRG25、siPAX8、miR - 939 - 5p 激动剂及阴性对照，利用 Lipofectamine 3000 进行质粒转染；使用携带 LncMSTRG25 的慢病毒感染 hBMSCs，设置 MOI 为 5。
3. RNA 测序分析：提取总 RNA 后去除核糖体 RNA，对 RNA 进行片段化处理，合成 cDNA，经纯化、修复、加 A 尾、连接测序接头等步骤，进行 PCR 扩增和测序，由专业公司进行数据分析。
4. 染色实验：通过碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红 S（ARS）染色，分别评估 hBMSCs 在成骨分化 7 天和 14 天的分化能力；采用免疫荧光和细胞骨架染色检测 PAX8、BMP2 和 RUNX2 的表达水平。
5. RNA 提取与定量：使用 Trizol 试剂提取 RNA，采用一步法 qPCR 试剂盒和 cDNA 合成试剂盒分别进行 mRNA 和 miRNA 的 cDNA 合成，以甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH）为 mRNA 和 lncRNA 的内参，U6 小核 RNA（snRNA）为 miRNA 的内参，通过 2^?ΔΔCt法计算靶 RNA 的相对表达量。
6. 蛋白质免疫印迹分析（Western blotting）：hBMSCs 成骨分化 7 天后，使用 RIPA 裂解液和蛋白酶抑制剂提取蛋白质，进行 BCA 蛋白定量，通过 SDS - PAGE 电泳将蛋白质转移至 PVDF 膜，经封闭、孵育一抗和二抗，使用化学发光仪曝光，用 ImageJ 软件分析图像。
7. 双荧光素酶报告实验：设计并合成重组双荧光素酶报告载体，将 hBMSCs 接种于 96 孔板，转染相关载体和 miR - 939 - 5p 模拟物或阴性对照，48 小时后检测萤火虫和海肾荧光素酶活性。
8. 荧光原位杂交（FISH）实验：使用 FISH 试剂盒检测 LncMSTRG25 和 miR - 939 - 5p 在 hBMSCs 细胞质中的表达，设计并合成特异性探针，用 DAPI 染色细胞核，通过共聚焦显微镜检测荧光信号。
9. RNA 免疫沉淀（RIP）实验：按照试剂盒说明书进行 RIP 实验，收集细胞裂解液，加入抗 PAX8 或 IgG 免疫沉淀磁珠，旋转反应过夜，洗涤后提取免疫沉淀的 RNA，通过 qPCR 检测 RNA 表达，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分析。
10. RNA 下拉实验（RNA pull - down）：利用 Pierce Magnetic RNA - Protein Pull - Down Kit 进行实验，设计并合成生物素标记的 LncMSTRG25 探针和对照探针，获取细胞裂解液，与预处理的磁珠结合，旋转孵育后洗涤、洗脱，通过 Western blotting 和银染分析 PAX8 表达。
11. 统计分析：定量变量以均值 ± 标准差表示，两组间比较采用双向 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），并使用 Bonferroni 检验进行事后两两比较。

研究结果

1. hBMSC 成骨分化中的差异表达基因：通过比较 hBMSCs 在 IL - 1β 处理组和对照组中的转录特征，发现共有 181 个 lncRNAs 在 IL - 1β 诱导的 hBMSCs 成骨分化中显著差异表达，其中 112 个上调，69 个下调。基因本体（GO）差异基因富集分析显示，IL - 1β 成骨诱导主要集中在正向调节细胞分化的生物学过程。
2. LncMSTRG25、miR - 939 - 5p 和 PAX8 在 hBMSCs 中的表达：经鉴定，hBMSCs 低表达 CD19、CD34 和 CD45，高表达 CD44、CD90 和 CD105。在成骨分化过程中，LncMSTRG25 和 PAX8 表达上调，miR - 939 - 5p 表达持续下调。通过多种软件预测并验证了 LncMSTRG25 与 PAX8、miR - 939 - 5p 的相互作用关系，且 LncMSTRG25 定位于细胞质。
3. LncMSTRG25 敲低抑制 hBMSCs 的成骨分化：设计针对 LncMSTRG25 的 siRNA，转染 hBMSCs 后，LncMSTRG25 表达显著降低，同时 PAX8 和包括 ALP、BMP2、RUNX2、COLL1、OPN 和 OCN 在内的成骨标记基因在 mRNA 和蛋白质水平的表达均受到抑制。体外成骨实验表明，LncMSTRG25 敲低的 hBMSCs 的 ARS 和 ALP 染色强度显著低于对照组，免疫荧光检测发现 PAX8、BMP2 和 RUNX2 的荧光强度也明显下降。
4. LncMSTRG25 过表达促进 hBMSCs 的成骨分化：将 Lv - LncMSTRG25 和 Lv - NC 转染 hBMSCs，选择 MOI 为 5 进行后续实验。结果显示，Lv - LncMSTRG25 转染组中 LncMSTRG25 表达显著升高，miR - 939 - 5p 表达受到抑制，PAX8 和各成骨标记基因的 mRNA 和蛋白质表达水平均显著增加。ALP 和 ARS 染色结果表明，Lv - LncMSTRG25 显著促进 hBMSCs 的 ALP 活性和钙沉积，免疫荧光检测显示 PAX8、BMP2 和 RUNX2 的荧光强度明显增强。
5. miR - 939 - 5p 对 hBMSCs 成骨分化的影响：转染 miR - 939 - 5p 激动剂或拮抗剂后，发现 miR - 939 - 5p 拮抗剂显著增加 PAX8 和关键成骨标记基因在 mRNA 和蛋白质水平的表达，促进成骨；而 miR - 939 - 5p 激动剂则抑制成骨。ALP 和 ARS 染色以及免疫荧光检测结果均证实了 miR - 939 - 5p 对 hBMSCs 成骨分化的显著影响。
6. miR - 939 - 5p 是 Lv - LncMSTRG25 介导的 hBMSCs 成骨分化的下游靶点：生物信息学预测显示 LncMSTRG25 可能是 miR - 939 - 5p 的靶点，双荧光素酶报告实验进一步验证了二者的结合关系。共转染 Lv - LncMSTRG25 和 miR - 939 - 5p 模拟物后，hBMSCs 中 PAX8 和骨生成相关基因的表达降低，ALP 和 ARS 染色强度减弱，免疫荧光检测结果也显示 PAX8、BMP2 和 RUNX2 的表达下降，表明 miR - 939 - 5p 部分阻断了 LncMSTRG25 的成骨促进作用。
7. PAX8 对 hBMSCs 成骨分化的影响：设计针对 PAX8 的 siRNA，转染 hBMSCs 后，PAX8 表达显著降低，同时成骨标记基因的表达受到抑制。体外成骨实验表明，PAX8 敲低的 hBMSCs 的 ARS 和 ALP 染色强度低于对照组，免疫荧光检测发现 PAX8、BMP2 和 RUNX2 的荧光强度下降，说明 PAX8 是 hBMSCs 成骨分化的重要调节因子。
8. LncMSTRG25 通过直接结合 miR - 939 - 5p 上调 PAX8，PAX8 敲低减弱 LncMSTRG25 对 hBMSCs 成骨分化的促进作用：预测并验证了 miR - 939 - 5p 与 PAX8 的结合位点，RIP 实验和 RNA 下拉实验证实了 LncMSTRG25、miR - 939 - 5p 和 PAX8 之间的相互作用。共转染 Lv - LncMSTRG25 和 siPAX8 后，hBMSCs 中 PAX8 和各成骨标记基因的表达上调受到抑制，ALP 和 ARS 染色强度减弱，免疫荧光检测结果显示 PAX8、BMP2 和 RUNX2 的表达下降，表明 PAX8 敲低可部分阻断 LncMSTRG25 对成骨分化的促进作用。

讨论

本研究发现骨折合并脾切除患者在骨折愈合初期促炎因子水平降低，而免疫炎症微环境对间充质干细胞（MSCs）的成骨分化有调节作用，IL - 1β 等因子通过不同信号通路影响 MSCs 的成骨分化。通过 RNA 测序分析筛选出与成骨分化相关的 LncMSTRG25，沉默 LncMSTRG25 抑制骨形成，证实了 LncMSTRG25 - miR - 939 - 5p - PAX8 轴在成骨分化中的重要作用。

lncRNAs 在基因调控中发挥关键作用，其作为 miRNA “海绵” 的机制备受关注。本研究通过生物信息学分析和实验验证，表明 LncMSTRG25 与 miR - 939 - 5p 存在 “海绵” 作用，LncMSTRG25 通过吸附 miR - 939 - 5p，解除 miR - 939 - 5p 对 PAX8 的抑制，从而促进 hBMSCs 的成骨分化。

PAX8 属于配对盒转录因子家族，在胚胎发育和细胞分化中起重要作用，对甲状腺细胞功能维持、心肌细胞发育等至关重要，且与骨形成密切相关。本研究发现 LncMSTRG25 显著促进 PAX8 表达和骨生成，PAX8 敲低则抑制骨生成，表明 PAX8 在 hBMSCs 向成骨细胞分化过程中起关键作用。

miRNA 在干细胞成骨分化中起重要调节作用，通过结合靶基因 mRNA 的 3′UTR 抑制翻译或切割 mRNA，调控基因表达。本研究发现 miR - 939 - 5p 在 hBMSCs 成骨分化过程中表达降低，过表达 miR - 939 - 5p 可阻断 hBMSCs 的成骨分化，进一步验证了其在成骨分化中的调节作用。

尽管本研究揭示了 LncMSTRG25 - miR - 939 - 5p - PAX8 轴对 hBMSCs 成骨分化的调控机制，但 LncMSTRG25 与其他动物的同源性较低，限制了体内动物实验。未来需进一步在体内验证 LncMSTRG25、miR - 939 - 5p 和 PAX8 对成骨的影响，探索其他 lncRNA - miRNA - mRNA 轴在脾切除后骨生成中的作用，观察 hBMSCs 联合 X 射线成像、微计算机断层扫描或静脉注射 lncRNA 修饰的 hBMSCs 的治疗效果，为骨折愈合的治疗提供更全面的理论依据和治疗策略。