RNase H1调控R-loop维持利什曼原虫DNA复制时序与基因组稳定性的机制研究

为解决真核生物DNA复制时序调控机制这一科学问题，格拉斯哥大学研究团队以利什曼原虫为模型，揭示了RNase H1通过调控R-loop（RNA-DNA杂交体）分布影响染色体大小依赖性复制时序的新机制。研究发现RNase H1缺失会导致复制时序紊乱、非整倍体增加和基因组不稳定性加剧，为理解单细胞真核生物适应性进化提供了新视角。

　　

在真核生物中，DNA复制通常遵循严格的时间程序，形成早期和晚期复制的染色体区室。然而，人类病原体利什曼原虫（Leishmania major）展现出独特的复制模式——其染色体完成复制的时间与长度成正比，大染色体复制更晚。这种反常现象背后的调控机制长期困扰着科学家。更引人关注的是，利什曼原虫表现出远超其他动基体纲生物（如布氏锥虫）的基因组不稳定性，包括普遍存在的非整倍体和基因拷贝数变异。这些特征是否与其特殊的复制程序相关？格拉斯哥大学Jeziel D. Damasceno团队在《Nature Communications》发表的研究，通过整合多组学分析和基因编辑技术，揭示了R-loop和RNase H1在协调这一独特复制程序中的核心作用。

研究团队运用DRIP-seq（DNA-RNA杂交体免疫沉淀测序）、ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）和MFA-seq（标记频率分析测序）等技术，结合条件性基因敲除系统，系统解析了R-loop与DNA复制时序的关联机制。首先通过S9.6抗体免疫荧光验证了R-loop在细胞核内的特异性分布，随后利用羟基脲同步化实验证明RNase H1缺失会加剧复制压力下的R-loop积累。

研究结果可分为四个关键发现：

1. R-loop的全局分布特征：DRIP-seq显示R-loop在基因间区富集，与剪接受体（SL）和polyA位点共定位，且密度与染色体长度正相关（r=0.77）。这种分布与染色质可及性（MNase-seq）和G四链体（G4）呈反向关联。
2. RNase H1的时空动态：ChIP-seq揭示RNase H1-HA主要定位于多顺反子转录单元（PTU）的链转换区（SSR），33%的R-loop峰与其共定位。同步化实验显示其染色体富集程度在S/G₂期最高。
3. 复制时序的重编程：RNase H1敲除后，早期复制区（如SSR）信号降低40%，而晚期复制区信号增加2.1倍，完全消除了染色体大小与复制时间的相关性（r从0.82降至0.11）。
4. 基因组不稳定性加剧：长期缺失RNase H1导致亚端粒和rRNA位点序列丢失，染色体4/12/31出现拷贝数变异，且突变偏好发生在RNase H1结合的R-loop区域。

这项研究首次建立了R-loop稳态与真核生物复制时序的直接联系，阐明了利什曼原虫通过RNase H1调控R-loop分布来维持大小染色体复制差异的分子机制。更深远的意义在于，这种机制可能解释该寄生虫独特的基因组可塑性——复制时序紊乱导致的非整倍体增加和亚端粒不稳定，可能正是其快速适应宿主环境的关键。研究为理解真核生物复制程序的进化多样性提供了新范式，并为针对R-loop通路设计抗利什曼病药物提供了潜在靶点。